楔叶茶藨对5/6肾切除小鼠肾损伤的保护作用研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、拟解决的问题

采用小鼠5/6肾切除模型，评价楔叶茶藨对慢性肾脏疾病的作用。

二、研究手段

材料

1.1 试剂

水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）、注射用生理盐水（石家庄四药有限公司）

表1 相关试剂盒信息

1.2 实验动物

ICR小鼠，清洁级，雄性70只，8周龄，体重 19-20 g，由扬州大学比较医学中心提供，许可证号：SCXK（苏）2012-0004。

1.3 实验仪器

AB135-S型电子分析天平（上海 Mettler Toledo 公司）、Milli-Q自动纯水机（美国 Millipore 公司）、DXC 800 型全自动生化分析仪（美国 Beckman Coulter 公司）、酶标仪（美国 BioRad 公司）、FSH-II型高速电动匀浆器（江苏省金坛市环宇科技仪器厂）、MR 23i型离心机（德国 Termo scientific 公司）。

2 方法

2.1 楔叶茶藨水提物制备

称量干燥楔叶茶藨300 g，按1:10的料液比加入水3 L，浸泡过夜，回流提取3次，每次4 h。合并提取液，减压回收水，得到楔叶茶藨水提取物。

2.2 楔叶茶藨水提物成分分析

高效液相

液质联用

2.3 动物饲养和管理

70只雄性 ICR小鼠自由饮水进食，饲养于温度为18~ 22℃、明暗各12 h 的SPF级实验室内，适应性饲养7天。

2.4小鼠5/6肾切除实验

适应性饲养后，4%水合氯醛（0.1 ml/10g）腹腔注射麻醉小鼠，置于手术台上。于左肋下1 cm 处行一斜向外下方切口0. 8～1 cm，切口约与鼠体长纵轴向内成45角，暴露左侧肾脏，分离肾上腺及肾周围脂肪，切除肾上下极组织各1 /3，用明胶海绵压迫止血后，复位肾脏并缝合。1 周后行II期手术，同样手法麻醉，切开右背暴露右肾，结扎肾蒂后切除整个右肾。故两次手术共切除约70% 肾脏。两次手术中，假手术对照组的小鼠仅仅暴露双侧肾脏并分离肾周脂肪、包膜后缝合。

2.5动物分组及给药

术后1周，将60只5/6肾切除小鼠分成6组，每组10只，分别为模型组、依那普利组、东北茶藨子果实水提物组、楔叶茶藨地上部分低、中、高剂量组（分别为40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg），假手术组10只。灌胃体积按照0.1 ml/10g计算，模型组和假手术组给予等体积双蒸水，连续灌胃给药至给药组相比于模型组出现显著性差异，每周记录体重。

2.6生理和生化指标检测

每周给药前称量小鼠体重（BW），记录摄食量（Food）和饮水量（Water），每周给药后，将每只小鼠置于代谢笼中，禁食不禁水，于25 ℃室温中收集各实验组大鼠24 h尿液，测定尿量（Urine）、尿肌酐（Ucr）及尿蛋白（Upro）。末次给药后，麻醉小鼠，腹主动脉采血分离血清，试剂盒检测血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、血清白蛋白（Alb）和加压素（Vasopressin）。分离残余肾组织，称重后用4%多聚甲醛溶液固定。

2.7细胞增殖评价

肾切除模型建立后，将BrdU（100 mg/kg 溶于生理盐水）（Sigma-Aldrich）皮下注射入小鼠，连续三天。实验结束后，固定肾组织并进行免疫荧光处理。

免疫荧光和免疫过氧化物酶技术均使用石蜡包埋的肾脏切片。染色前对切片进行脱蜡处理。然后将切片用柠檬酸盐缓冲液（pH6）在100℃处理10分钟以进行抗原修复。对于免疫荧光，蜡片与一抗共孵育（4℃，过夜），随后与FITC缀合合适的二抗（室温下，1小时）。洗涤后，将载玻片湿润固定在PBS /甘油（1:1）或含有4,6-二脒基-2-苯基吲哚的封固剂（染色细胞核为蓝色）中用于显微镜检查。

3.7肾组织病理检查与免疫组化

2期手术后2周，取血后，立即切取一侧肾脏，在4℃生理盐水中洗去残肾周围脂肪组织等成分，清除残留血液后用滤纸吸干水分，放入10%福尔马林固定液中固定，固定后24h后制作蜡块和病理切片。对肾脏切片进行HE染色，Masson染色。采用半定量评分法对肾小球硬化程度进行评分。

用于免疫组化的一抗有：小鼠抗alpha;-SMA（肾小管间质性纤维化标记），小鼠抗BrdU（细胞增殖标记），山羊抗波形蛋白（上皮向成肌纤维细胞转化的标记），山羊抗IV型胶原（基底膜标记）；小鼠抗WT-1（肾间充质干细胞标记物，肾小球足细胞的WT-1阳性认为是肾小球修复的标志）；羊抗CD34（血管内皮祖细胞和血管标记）；兔抗Sca-1（造血鼠干细胞标记物）；和山羊抗-P. vulgaris凝集素（近端小管的终末分化标志物）。

3.8肾小球WT-1细胞计数及其RT-PCR定量

对肾切片进行WT-1免疫染色后，在3200放大倍数下对肾小球进行数字照相。手动计数每个肾小球中的WT-1阳性细胞。同时，使用ImageJ软件测量肾小球区域。计算每个肾小球的计数/面积的比例（以平方像素为单位）。将各组中WT-1计数/面积比的平均值用于各组之间的比较。

3.9肾脏组织中生长因子的测量（VEGF，HGF和IGF-1）

血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）和胰岛素样生长因子（IGF-1）对于肾损伤的修复具有重要作用。使用ELISA试剂盒测定VEGF、HGF和IGF-1的含量。

慢性肾炎的相关细胞因子和信号通路

摘要：慢性肾炎是一组多病因的慢性肾小球病变为主的肾小球疾病，但多数患者病因不明，它可能是由于各种细菌、病毒或原虫等感染通过免疫机制、炎症介质因子及非免疫机制等引起本病。慢性肾炎一直被看做无法逆转的病变，而随着研究的深入，一系列相关的细胞因子和细胞通路被相继发现。本文主要围绕1.细胞因子：肿瘤坏死因子（TNF-alpha;）；巨噬细胞移动抑制因子 (M IF)；转化生长因子 beta; 及其信号转导分子 Smad

2.信号通路：核因子-kappa;B/Ikappa;B 信号通路； Wnt /beta; － catenin 信号通；c-Jun 氨基末端激酶-激活蛋白 1 信号通路；p 3 8 丝裂素活化蛋白激酶信号通路；等作出介绍。并对其前景作出展望。

关键词： 慢性肾炎 细胞因子 信号通路 肿瘤坏死因子 转化生长因子beta; 核因子

背景：慢性肾损伤是一种进行性的且不可逆转的肾功能受损，在临床上已经成为了一个极其棘手的问题。慢性肾损伤通常会逐渐地且不可避免地发展为肾功能的完全丧失继而导致肾衰竭（andrea）。慢性肾损伤的发展涉及到一些列极其复杂的且相互交错的细胞因子和信号通路。 即使在研究其发病机制方面投入了大量精力，其分子生物学机制尚不明了。

1.细胞因子

1.1 肿瘤坏死因子（TNF-alpha;）

肿瘤坏死因子（TNF），以前也被称为TNF-alpha;，是其家族中最令人熟知的成员。肿瘤坏死因子是一种单核细胞源性的细胞毒素，并能够引起肿瘤的回归，脓毒性休克，恶病质等一系列生化病理反应.^[1][2]这种蛋白质以一种前体激素的方式合成，并包含了一个大多数细胞因子少见的较长的信号序列.^[3] 在慢性肾损伤的发展中，肿瘤坏死因子一直被看作是重要的炎症因子。肾小球及其基质的硬化与增生与其息息相关。刘^[4]等首先采取HE 及免疫荧光分别对对照组和实验组的肾小管及肾小球进行形态表征，结果显示肾小球呈弥散性肿胀且细胞增生，系膜细胞增生明显。肾小球细胞水肿变性，且伴随炎症细胞浸润。随后的免疫组化显示，肿瘤坏死因子在肾小管上皮细胞中显示强阳性。由此可见，肿瘤坏死因子在慢性肾损伤中可能通过介导炎症反应而发挥作用。尤其是其在肾小管中的高表达，暗示了其在肾间质纤维化中发挥的重要角色。

1.2 巨噬细胞移动抑制因子 (MIF)

巨噬细胞移动抑制因子，又被称为糖基化抑制因子（GIF），作为一种由MIF基因编码的蛋白^[5][6]，在先天免疫中扮演了重要的角色，能够限制体内巨噬细胞的活动。在一般的炎症反应中，MIF能够抑制抑制巨噬细胞的游走，促进其在炎症部位的募集，进而促进炎症反应的发生，抑制糖皮质激素的抗炎作用。师^[7]等收集了32例不同程度肾炎患者的病理切片，并将其分为轻度，中度，重度三类。通过免疫组化双标记法，比较了正常肾组织和不同程度肾炎组织的巨噬细胞移动抑制因子的表达情况。发现，健康肾组织中的MIF表达很轻微，但肾炎组织中的MIF表达剧增，且随着病程的发展而增加。且发现，应用MIF抗体可改善炎症反应，减轻肾损害。

1.3 转化生长因子 beta; 及其信号转导分子 Smad

1.3.1 TGF-/Smad7

TGF-/smad7 能够促进肾脏纤维化，但其调控增值基因的机制尚不明确。Arthur^[8]等假设miR-192，即一种在肾脏中表达的mRNA能够通过调节smad3来调节肾脏纤维化。通过实时PCR技术，发现因子smad7的缺失能够促进miR-192的表达进而促进纤维化的发生。反之，大量smad7的表达能够抑制miR-192的表达从而在5/6肾切除小鼠模型中抑制肾脏纤维化

1.3.1 TGF-/Smad4

史^[9]等收集了20例正常肾组织及38例不同程度肾小球肾炎的活体样本。通过免疫组织化学的方法观察细胞因子TGF-beta;和smad4 在肾小球组织中的染色程度。并利用实时PCR技术反映病变肾小球中smad4和TGF-beta;的表达程度，其表达蛋白产物则用western blot测定。通过对照发现，所有病变类型中，肾小球的TGF-beta;和smad4均高于对照组（plt;gt;），且外源性的TGF-beta;也能够显著地刺激smad4 基因的表达。因此有理由相信，TFG-beta;及其下游信号分子smad4能够促进肾小球肾炎的发展。

2.信号通路

2.1 核因子-kappa;B(NF-kappa;B)/ Ikappa;B 信号通路

核因子-kappa;B(NF-kappa;B)/ Ikappa;B 信号通路一直是肿瘤学研究的热点，NF-kappa;B是一种核因子，其重要的生物学作用便是调控基因的表达，进而调节细胞的凋亡，肿瘤坏死因子通过抑制核因子-kappa;B(NF-kappa;B)从而促进肿瘤细胞的凋亡^[17]。在炎症反应中，核因子-kappa;B (NF-kappa;B)同样扮演了重要的角色，与炎症介质的产生 、细胞增殖 、细胞外基质交联和细胞凋亡有关的转录因子，参与了多种炎症反应的信号转导过程.^[10] 张^[11]等利用雄性SD大鼠免疫新西兰兔，获得了肾毒血清性肾炎模型。通过免疫印迹法检测肾炎大鼠肾组织中NF-kappa;B的表达情况。并通过免疫组化的方法检测其肾炎组织中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的量。结果发现，肾炎组织中MCP-1的含量显著高于对照组，并与NF-Kappa;b的表达相一致。由于单核细胞趋化因子是反映炎症反应的直观指标，间接表明表明核因子-kappa;B(NF-kappa;B)/ Ikappa;B能够介导MCP-1的表达，从而促进慢性肾炎发展中炎症反应的进程。

2.2 Wnt/beta; － catenin 信号通路

Wnt/beta; － catenin 信号通路是生物进化过程中极为保守的通路。无论是从线虫到高等动物，Wnt/beta; － catenin 信号通路在动物的发育以及维持生长的平衡方面发挥了不可替代的作用。Wnt/beta; － catenin 信号通路^[14]主要通过beta; － catenin向动物的细胞核内发送信号，调控其下游靶基因的表达，从而调控细胞的增殖和凋亡。Wnt/beta; － catenin 信号通路一直被看做肿瘤研究的内容，多种肿瘤，例如乳腺癌和胰腺癌，的发生都与其显示出一定的相关性。近年来，随着研究的深入，Wnt/beta; － catenin 信号通路在肾病的发展过程中的作用也逐渐引起大家的重视。邓^[12]等研究了黄芪对肾病大鼠肾间质中Wnt/beta; － catenin 信号通路的影响，间接证实了Wnt/beta; － catenin 信号通路在慢性肾炎方面的作为治疗靶点的潜力。研究发现，黄芪能够下调Wnt/beta; － catenin的表达，并与肾病指标（肌酐，尿素氮）的改善相一致。研究表明Wnt/beta; － catenin或可作为潜在的临床治疗靶点。

2.3 p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是人体内极为重要的信号转导通路，而P38作为其中的一个亚族，通过转录因子的磷酸化而调控基因的表达，从而介导了人体生长发育以及各类炎症反应的全过程，在各类疾病的发展过程中具有重要作用^[16]。周^[13]等利用MTT比色法评估了p38MAPK 阻断剂 SB203580对体外培养大鼠系膜细胞的增值作用。结果表明单核细胞趋化蛋白-1能够促进大鼠系膜细胞的增殖。而这种增殖能被p38MAPK 阻断剂 SB203580所抑制，提示p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在肾损伤细胞增殖修复过程中所扮演的促进作用。此外，另有报道表明p38能够促进肿瘤坏死因子（TNF-alpha;）的表达，从另一个方面促进慢性肾炎的进展。因此，p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路在肾炎发展中的作用十分复杂，其作用细节尚待研究。

展望：

随着生活水平的提高，慢性肾炎的发病率逐年上升，且逐渐表现出低龄化。临床上，慢性肾炎一旦进入中后期，往往难以逆转，且尚未发现特效药。以上提及的各类细胞因子和信号通路均表现出潜在的治疗价值，但它们在实验中表现出的作用往往不是单方面的，甚至是相互影响或者从另一个角度来说是有害的，而要获得疗效确切、安全的药物，就必须对其作用机制作出更为详尽的研究。但可以预见的是，对于以上信号通路或者细胞因子的调控，将是未来减缓乃至逆转慢性肾炎发展的重要途径。

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开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、拟解决的问题

采用小鼠5/6肾切除模型，评价楔叶茶藨对慢性肾脏疾病的作用。

二、研究手段

材料

1.1 试剂

水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司）、注射用生理盐水（石家庄四药有限公司）

表1 相关试剂盒信息