白介素-17信号通路中新分子的筛选与鉴定文献综述

研究意义:

自身免疫病(autoimmune diseases)是一种由于机体免疫平衡被打破,使得免疫系统攻击自身组织所致的免疫疾病，其种类繁多,发病率亦呈现逐年增长趋势，加之目前仍无无特异性治疗方法，已成为直接威胁人类生命健康和影响生活质量的严重疾病。

近年来研究发现，Th17 T细胞及其产生的特征性细胞因子白介素-17（IL-17）在多种自身免疫病的发病病理中发挥着关键性的作用。IL-17或者IL-17受体(IL-17R)基因剔除小鼠对多种自身免疫病如CIA、和EAE（分别为类风湿性关节炎和多发性硬化症的小鼠疾病模型）等的诱导产生抗性，表明其在自身免疫病的发病机理中的重要作用。此外，自身免疫病病人的特定性病理组织中IL-17的mRNA和蛋白水平都明显上调。Th17 T细胞和IL-17的生理学和病理学研究已成为免疫学界研究的热点和世界前沿科学。重要的是，针对IL-17或者IL-17R的功能阻断性抗体在自身免疫病如类风湿性关节炎和牛皮癣等临床试验中取得非常有效而且副作用小的治疗效果。然而，IL-17发挥功能的作用机制还不清楚。本研究拟筛选并鉴定白介素-17信号通路中新分子,为针对IL-17信号通路的自身免疫病的特异有效治疗提供理论基础与新型靶点。

研究内容:

IL-17通过结合IL-17RA和IL-17RC受体二聚体向下传导信号。除了IL-17（也称IL-17A），IL-17家族还包括其他五个成员IL-17B到IL-17F。IL-17RC是IL-17和IL-17F发挥功能的特异性受体，而IL-17RA是IL-17家族的共享受体。IL-17作用于不同的细胞类型如成纤维细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经星型细胞、上皮细胞和巨噬细胞等，通过诱导炎症性细胞因子、趋化因子等导致组织部位炎症效应，促进自身免疫病如CIA、EAE等病理进程。IL-17RA和IL-17RC含有一个保守的胞内蛋白结构域，其结构类似于IL-1/TLR家族中的TIR结构域，称为SEFIR结构域。SEFIR结构域可以通过招募下游信号分子Act1来激活NFkB，JNK，P38，ERK，C/EBP和mRNA稳定性等通路。目前研究得比较清楚的是Act1-TRAF6-TAK1和Act1-TRAF2/TRAF5-SF2信号通路，而IL-17受体，特别是IL-17RC作为IL-17信号通路的特异性受体，它是否还会招募新的信号分子来介导下游通路的激活仍处于国际研究的空白。IL-17激活下游其他通路如JNK、P38、和ERK等中的分子机制研究也仍很不清楚。IL-17是一个重要的促炎细胞因子，其信号转导很可能存在精细调控以避免过度的炎症效应，这有待进一步筛选靶向IL-17RC受体的调控分子。为此，该项目拟通过IL-17RC为诱饵的酵母双杂交、分子克隆、免疫共沉淀等手段筛选与鉴定IL-17信号通路中新的信号分子。具体研究内容如下:

1.酵母双杂交

将用于筛选的诱饵基因IL-17RC通过PCR的方法扩增并克隆到pGBKT7载体（Clontech）上，测试IL-17RC分子在酵母筛选系统中有无自激活，优化条件后，用于酵母双杂交筛选。将用于筛选的诱饵基因IL-17RC和pACT2人脾脏cDNA文库一起共转染酵母，筛选相互作用蛋白分子。从阳性酵母克隆中抽提质粒，经测序获得候选信号分子序列，通过网络数据库获取分子全序列。备选方案：如果酵母双杂交系统未能获得理想结果，我们将通过GST-pulldown和免疫共沉淀结合质谱等手段进行新分子筛选。

2.候选分子的分子克隆

将筛选得到的候选信号分子通过分子克隆的方法克隆到pcDNA3.1的质粒上。首先根据NCBI数据库获得候选分子基因的详细信息,分析其酶切位点,设计合适的RT-PCR引物检测这些基因在不同cDNA库中的表达情况,然后挑选表达高的cDNA库,设计合适的带酶切位点的PCR引物将目的基因扩增出来,并通过酶切连接的方式装到pcDNA3,1质粒上,为了方便检测可以给这些目的基因加上HA或FLAG的蛋白标签。最后从阳性克隆中抽提质粒，经测序获得含有正确序列的候选分子基因用于后续实验。