肺纤维化形成中水通道蛋作用机制研究文献综述

开题报告

研究背景

肺纤维化是一种以肺间质弥散性渗出、浸润和纤维化为主要病变的疾病，包括特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）和继发性肺纤维化（secondary pulmonary fibrosis,SPF）。其特点为发病病程长，主要表现为进行性肺间质纤维组织增生，肺泡壁明显增厚导致出现疤痕，肺毛细血管床开始减少，造成肺部通换气障碍，导致出现肺静脉、肺动脉高压，严重时会导致右心衰竭。肺纤维化的主要临床表现为咳嗽、呼吸困难、低血氧症等，终末期的患者会因出现呼吸衰竭而亡。主要体征是可在肺底部闻及吸气末的爆裂音，少数患者可能出现杵状指。

肺纤维化一直以来都是国内外医药工作者想要攻克的一大难题，我国45岁以上人群中，70％以上都患有不同程度的慢性肺病，其中因肺病死亡的患者中，由45％是死于肺纤维化。肺纤维化的病理分型复杂；病程长短依赖于病情的进展，早期病症不明显；并且目前对于该疾病的发病机制尚未明确，导致患者的死亡率高，是一种严重危害人类生命健康的严重疾病。

国内外研究现状

1.水通道蛋白（aquaporins,AQPs）是一类能够介导水分子跨膜转运的细胞膜蛋白，主要调节器官中表面液体和气体的湿化过程。

2.AQP4的基因由四个外显子组成，分别编码127、55、27、92位氨基酸序列，其间有三个内含子，长度分别为0.8、0.3和5。2Kb。用原位杂交免疫荧光法观察发现，人类AQP4基因位于染色体18q11.2与q12.1之间的连接处。

3.肺泡上皮细胞覆盖了99％以上的肺气腔表面，包括扁平的Ⅰ型和立方形的Ⅱ型细胞。并且，已有研究表明在Ⅰ型和Ⅱ型细胞表面都含有含功能的AQPs。

4.水通道蛋白的表达参与气道湿化的参与，以及气道表面液体的生成和分泌，有文献表明气道表面液体层的改变是肺部囊性纤维化表现的中心。

5.研究发现肺纤维化的发病机制可能与急性、持续或反复发生的肺损伤和炎症有关。半胱氨酰白三烯（Cysteinyl leukotienes,Cys LTs）是重要的炎症物质，主要通过Cys LT1类受体（Cys LT1R）和Cys LT2类受体（Cys LT2R）发挥作用。

6.在BLM诱导肺纤维化的小鼠模型中，靶向断裂胞浆磷脂酶A2阻断LTs的生成，可以明显减轻肺纤维化的程度；在BLM诱导的肺纤维化肺部组织中，Cys LT1R表达增高，而Cys LT2R表达降低，而使用Cys LT1R拮抗剂后能够调节两种受体重新回到平衡进而改善肺纤维化。

7.有研究进一步提出，AQP4在慢性阻塞性肺病患者的器官中表达的越少，导致气道湿度减低，气道表面液体渗透压升高，高渗应激通过MAPK信号转导通路使炎症反应增加。AQP4表达的减少也会导致炎症细胞发生迁移并且释放炎症因子。

8.研究发现经气管内灌注博来霉素可以造成小鼠肺纤维化,其病理组织学和生理学的改变均与人类肺纤维化近似,因此常常用此药来制作肺纤维化模型。

9.目前已经有研究表明，AQP4主要分布于支气管、气管的纤毛柱状细胞的基底侧膜以及鼻咽部的上皮下腺体。

10.对AQPs的调节存在长期和短时调节之分。长期调节作用在核酸转录水平上, 主要表现为AQPs的mRNA合成增加, 蛋白表达量增强, 如皮质醇类激素可以从该水平上增加AQP1的表达。短时调节主要表现为细胞质内的囊泡等膜单位短时与细胞膜融合, 它们膜上的AQPs转移到细胞膜上, 导致细胞膜单位面积上AQPs的量短时增加。

11.现在尚未发现针对AQP4的特异性拮抗剂，目前大部分对于AQP4在肺部作用机制的研究都基于使用基因敲除小鼠。

研究意义

在维持肺的正常生理功能过程中AQPs发挥着重要作用。通过分析疾病发生发展过程中肺纤维化与AQP4的相关机制研究，发现二者之间存在的关联，或许能够为开发治疗肺纤维化药物提供新的靶点和研发思路。

主要内容

1.肺纤维化小鼠的建模

2.数据的收集和统计

3.小鼠纤维化程度与AQP4表达程度的关联性分析

研究方案

取成年小鼠（20-30g）5只,所有小鼠符合实验动物饲养指南。

肺纤维化小鼠造模采用博来霉素气管内一次性给药：腹腔注射5％水合氯醛麻醉小鼠（400mg/kg）,麻醉后固定在手术台上，暴露气管，注射器向心方向经气管注入博来霉素（3mg/kg）,注射后不取针头，从肺中抽出0.1ml空气再次推入。随后上下颠倒小鼠身体，是药液分布均匀。待小鼠清醒后常规饲养，自由饮食，12h明暗交替，温度适宜（22plusmn;1℃）。以给药日期记为0d，每日记录小鼠体重。给药12d后处死小鼠，取小鼠肺部进行检测。

1.肺系数：肺系数=(肺重/体重)times;100(g/g),其值越高说明肺病变程度越重。

2.肺组织病理学观察：取肺组织固定、脱水包埋,制成4 为mu;m切片行HE及Masson染色, 光学显微镜下观察肺组织病理学改变。

4.羟脯氨酸检测：按照碱水解法测定肺组织中羟脯氨酸含量。

3.Western blotting测定Cys LT1R、Cys LT2R蛋白：按报道的方法提取小鼠肺组织蛋白,考马斯亮蓝法测定肺组织蛋白浓度。相应浓度和等量的样品蛋白经SDS-PAGE电泳转膜,漂洗封闭后,分别放入混有兔抗小鼠Cys LT1多克隆受体(1∶500)、GAPDH(小鼠单克隆抗体1∶5000)及Cys LT2多克隆抗体(1∶500)、 GAPDH的一抗及二抗(1∶5000) 进行免疫反应, 膜漂洗后利用成像系统,以GAPDH为内参用Quality One软件, 结果以Cys LT1R、Cys LT2R与GAPDH的条带光密度值相对百分比表示。

4.检测AQP4 mRNA表达情况

5.绘制小鼠体重与时间的关系图

6.统计学计算：正态分布计量资料以均数plusmn;标准差表示。以P lt; 0.05为差异有统计学意义。

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