JMJD2A小分子抑制剂的设计与合成与生物学评价文献综述

1.课题的背景及研究进展

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科。^[1]表观遗传学对理解基因的表达和调控具有十分重要的意义,在肿瘤、免疫紊乱等许多疾病发生机制的理解和防治中具有广泛的应用。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic imprinting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。组蛋白甲基化是重要类型之一,该修饰与异染色体形成、X染色体失活、特定基因转录调节、基因组完整性及细胞发育等都具有密切联系。组蛋白甲基化主要发生在组蛋白H3或H4的赖氨酸和精氨酸残基上,其中以H3的赖氨酸甲基化最为常见,如4位(H3K4)、9位(H3K9)、27位(H3K27)、36位(H3K36)、79位(H3K79)等,而且这些位置的赖氨酸残基不仅有一甲基化修饰,还有二和三甲基化修饰,这些修饰可造成附近DNA表达受到抑制,从而达到基因表达下调的目的。组蛋白甲基化原来被认为是一种稳定修饰,而去甲基化酶的发现则说明甲基化修饰和其他蛋白修饰一样也是一种可逆过程。

至今已发现两大类去甲基化酶,一类属于氨基酸氧化酶家族成员的赖氨酸特异性去甲基化酶(LSD1),该类目前只发现一个成员。LSD1主要催化一甲基化或二甲基化的H3K4去甲基化,其催化过程需要FAD协助完成;另一类为包含Jumonji结构域的蛋白质（JMJD)家族,该家族种类较多,催化多种底物,需要二价铁离子和alpha;-酮戊二酸的参与。JMJD家族成员的N端和C端都包含一个转录因子家族Jumonji小的特征结构域(分别称为JmjN和JmjC)。JmjN结构域与转录调节相关,而JmjC是JMJD家族酶活性中心的组成之一,因此该家族又被称为包含JmjC结构域的组蛋白去甲基化酶（JHDM)家族。JMJD家族目前已鉴定多个成员，如JHDM1A、JHDM1B、JMJD1A、JMJD2A、JMJD2B等，其中JMJD2A对H3K9和H3K36都有去甲基化作用。

2.研究方向

JMJD2A是一种组蛋白去甲基化酶。它可以催化三甲基化或二甲基化状态的H3K9和H3K36去甲基化到不同的甲基化水平，这种催化能力是依赖Fe(II)和a-酮戊二酸实现的。JMJD2A分子包含JmjN, JmjC, PHD, Tudor四个结构域，其中JmjN和JmjC结构域位于N端，它们对于去甲基化酶的活性是必需的;Tudor结构域位于C端，它可以结合到甲基化修饰的H3K4和H4K20位点上，这对于JMJD2A定位到特定的染色体区域是必需的^[2]。

有报道称人的乳腺癌样品中JMJD2A的蛋白水平和mRNA水平都是高表达的^[3];在前列腺^[4]和肺癌^[5]中JMJD2A蛋白过表达;在膀肤癌样品中JMJD2A的mRNA水平上调^[5];在鳞状细胞癌中，JMJD2A高表达与其恶性转移密切相关^[6]。研究表明在乳腺癌细胞^[3]、结肠癌细胞^[7]、肺癌细胞和膀胧癌细胞^[5]中敲低JMJD2A都可以使细胞增殖减缓。当在结肠癌细胞中敲低JMJD2A使得p21和PUMA的表达增多而Bcl-2的表达减少^[7]，在乳腺癌细胞中敲低JMJD2A则可以使cyclinDl和c-jun的表达均减少^[3]，在鳞状细胞癌细胞中敲低JMJD2A使得AP-1的蛋白和mRNA表达水平都下调^[6]，这些结果表明JMJD2A在这些肿瘤细胞中是一种原癌基因。JMJD2A作为一种去甲基化酶参与了组蛋白修饰，所以其必然可以通过影响染色体的可塑性来参与一些基因的调控。ChIP实验己经证明ADAM12, CXCL5,JAG1^[5]以及ASCL2, CHD5是JMJD2A直接调控的靶基因^[8];在鳞状细胞癌细胞中，JMJD2A可以促进AP-1结合在自身成分的启动子上诱导其表达，从而对AP-1的表达形成正反馈调控^[5]。另外，JMJD2A还可以作为转录因子的辅激活子或者辅抑制子的结合蛋白来间接调控基因的表达。有研究表明JMJD2A可以作为AR的辅激活子激活它们各自的靶基因^[4]；另一些研究则表明JMJD2A可以与RB、HDACs结合在一起抑制E2F1靶基因的启动子活性^[9]，它也可以与p53结合抑制p53对p21的转录激活^[7];另外，Nco-R可以帮助JMJD2A抑制ASCL2的转录。

JMJD2A也与细胞周期相关，它可以参与调控细胞周期的运转。研究表明在结肠癌细胞中敲低JMJD2A可以使G2/M期细胞增多,当过表达JMJD2A时则能使细胞通过S期的速度加快^[10]。

JMJD2A自身的蛋白含量通过蛋白-泛素酶体途径调控^[2]。研究发现,JMJD2A自身蛋白水平具有细胞周期依赖性。在整个细胞周期中，JMJD2A的mRNA水平稳定，但其蛋白水平具有周期性，在G1/s期达到高峰，而在G2/M期最低。出现这个现象的原因是JMJD2A在特定的细胞周期时相被SCFFBX022泛素连接酶识别从而被多泛素化修饰而降解^[2]。JMJD2A也参与了DNA损伤修复的过程，这也是由于泛素化修饰造成的。在DNA正常的情况下，JMJD2A会结合在二甲基化修饰的H4K20位点;当DNA受损后，E3连接酶RNF8会被激活，然后识别JMJD2A使其泛素化后被降解，这时候DNA损伤修复相关蛋白就可以结合到JMJD2A原来结合的位点上进一步招募p53参与DNA修复^[11]。

目前JMJD抑制剂主要有a-酮戊二酸类、含氮芳香环类以及异羟肟酸类等。^[12]有研究表明，2-OG衍生物是一类有效的JMJD2A抑制剂，能竞争性抑制2-OG，如N-草酰甘氨酸（NOG,1）对JMJD2A的IC₅₀为250mu;mol·L^-1，它还能作用于其他氧化酶，对人缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor，HIF）脯氨酸羟化酶2（HIF prolyl hydroxylase 2，PHD2）和天冬酰胺羟化酶因子抑制性HIF（asparaginyl hydroxylase factor-inhibiting-HIF，FIH) 的K_i为8mu;mol·L^-1和1.2 mmol·L^-1[13],使体内H3K9me3水平提高。含氮芳香环类JMJD抑制剂保留了羧酸官能团，且有较高活性，如2,4-吡啶二羧酸（PCA，17）能抑制JMJD2A，其IC₅₀为0.7mu;mol·L^-1。PCA和 KDM4A的结合方式与NOG类似，吡啶氮和2位羧基以及KDM4A上 Glu190和His276分别与Ni（Ⅱ）螯合，吡啶环与Tyr177、Phe185 和 Trp208形成疏水键，4位羧基与Lys206上氮和Tyr132上羟基形成氢键，可竞争性抑制2-OG。植物生长调节剂丁酰肼可选择性抑制JMJD2A，IC₅₀为1.5mu;mol·L^-1，其作用机制可能是通过二甲基氨官能团而竞争性抑制JMJD2A中的二甲基化赖氨酸残基实现的^[13]。目前越来越多的证据表明JMJD抑制剂中类似于2-OG的结构非常重要，因此，在抑制剂化合物的设计过程中，应尽量保留该官能团，然后根据晶体结构进行优化，使得JMJD抑制剂的结构设计和修饰更趋合理，从而有望开发出高效低毒的 JMJD 抑制剂。

3.预期目标