姓名

刘依宁

学号

15405622

专业

中药学

指导教师

寇俊萍

课题名称

NMMHCⅡA敲除前后小鼠体内代谢物的变化规律研究

课题性质

✔ 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

开题报告

一．研究目的

非肌肉肌球蛋白是不存在于肌细胞中的肌肉蛋白，其中研究较多的是非肌肉肌球蛋白Ⅱ（non-muscle myosin Ⅱ，NMⅡ）。NMⅡ是一种分子马达，能为细胞提供动力。除此以外它还参与许多生理活动，如细胞迁移、细胞黏附、细胞分裂、细胞分泌、细胞修复、器官发育、细胞内物质转运和信息传导等。NMⅡ的存在形式为六聚体，包括两条重链、四条轻链以及ATP依赖的动力蛋白^[1]。其中重链为非肌肉肌球蛋白重链（non-muscle myosin heavy chain Ⅱ,NMMHC）根据重链的不同，NMMHCⅡ又分为NMMHCⅡA、NMMHCⅡB和NMMHCⅡC这三种亚型，分别由MYH-9、MYH-10和MYH-14这三种基因编码，其中NMMHCⅡA的ATP水解酶活性最大，深受学者们的广泛研究^[2-3]。

目前的研究发现NMMHCⅡA在许多疾病发病过程中，如肿瘤的迁移、血栓性疾病的发生、遗传性疾病的发生、听力障碍、炎症、眼部疾患以及肾功能损伤等方面都起到重要的作用。比如恶性肿瘤的主要特征之一就是肿瘤转移，而NMMHCⅡA使细胞迁移、黏附，介导胞质分裂，在肿瘤细胞浸润、转移中发挥重要作用^[4]。血小板里唯一表达的Ⅱ型肌球蛋白为NMMHCⅡA，能正性地调节血栓的形成，有研究表明其能导致血栓性疾病的发生。NMMHCⅡA的基因名为MYH-9，特异性存在于血小板、淋巴细胞和中性粒细胞中，该基因突变引起的疾病为MYH-9相关病症，是一种非常罕见且严重的遗传性疾病，但是NMMHCⅡA对这些疾病的影响的相关机制还未完全阐明^[5]。

二．拟研究或解决的问题

研究NMMHCⅡA内皮条件性敲除后小鼠体内代谢物的变化规律，可以更好地理解并研究心血管、肿瘤及炎症等疾病中NMMHCⅡA的作用机制，为疾病的诊断、生物标记物的筛选以及新药的研发等提供一定的参考和理论依据。

三．采用的研究手段及内容

本次研究以代谢组学为研究方法，运用高通量检测技术中的液相色谱法-飞行时间质谱法联用（LC-TOF/MS）技术和主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法判别式分析（OPLS-DA）等数据处理方法来研究NMMHCⅡA内皮条件性敲除后小鼠体内代谢物的变化规律。

四．成果形式

成果将以基础研究论文形式呈现。

1. 课题进度

2019.3-2019.4月，熟悉实验室规则，进行文献查阅整理，学习基本动物实验操作及取样方法，准备开题报告及进行实验预试；2019.4月-2019.5月，进行主体实验研究；2018年6月整理数据，撰写论文，进行毕业答辩。

六．文献综述

NMMHCⅡA的生理病理功能

摘要：非肌肉肌球蛋白是哺乳动物中表达的一种重要蛋白，是细胞骨架的组成成分，为细胞质流动、细胞器运动、物质运输、有丝分裂、胞质分裂和细胞的顶端生长等提供所需的动力，参与细胞的吞噬、运动、受精和吸收等生理过程。其中，NMMHCⅡA是非肌肉肌球蛋白的重要亚型之一，不仅参与了多种细胞过程，在多种疾病中也起着关键作用。本文就近年来发表的NMMHCⅡA相关生理功能及疾病进行整理，为研究NMMHCⅡA提供线索。

关键词：NMMHCⅡA；癌症；血栓；遗传疾病

1．参与癌症的发生与发展

癌症的转移是患者治疗失败死亡的主要原因，治疗肿瘤的一大障碍就是限制肿瘤细胞的侵袭和转移能力。NMMHCⅡA通过改变细胞骨架结构和MYH-9的合成能力从而调节肿瘤迁移、侵袭，其与肿瘤转移密切相关^[6]。

刘军等^[7]在研究中发现，癌旁组织中MYH-9 mRNA的相对表达量较癌组织明显减少；MYH-9蛋白在肿瘤组织中主要表达于细胞质中，且MYH-9蛋白在癌组织中表达显著高于癌旁组织；沉默MYH-9基因能降低骨肉瘤细胞上皮间质转换，进而降低骨肉瘤的侵袭能力。有研究表明，采用实时荧光定量PLR和western blot分析膀胱癌细胞株中NMMHCⅡA的表达情况，采用划痕实验检测细胞的迁移能力及Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭能力，结果表明NMMHCⅡA可促进膀胱癌细胞侵袭及转移能力^[8]。蒋宁^[9]研究发现NMMHCⅡA在肝癌组织的表达显著高于癌旁组织，MYH-9低表达能有效抑制肝癌细胞的增殖，促进其凋亡。有报道发现，乳腺癌与正常乳腺中存在重链NMMHCⅡA，且在乳腺癌中表达均高于正常乳腺，NMMHCⅡA与乳腺癌恶性程度密切相关^[10]。另有研究表明， MYH-9基因与胃癌进展密切相关，是促进胃癌侵袭和转移的重要基因^[11]。Mirella Georgouli等^[12]通过研究表明，ROCK肌球蛋白Ⅱ在转移性散播过程中促进癌细胞内的快速圆形变形虫迁移。肿瘤细胞中高肌球蛋白Ⅱ活性可重新编程先天免疫微环境来支持肿瘤生长。Arthur J. Kuipers等^[13]研究发现通道激酶TRPM7是一种与机械感觉过程有关的细胞张力调节器，在体外和体内对乳腺癌转移是必需的，其通过抑制肌球蛋白Ⅱ的活性来降低细胞骨架的张力，TRPM7可能通过SOX4的张力调节促进乳腺癌的进展。另有研究发现，非肌肉肌球蛋白Ⅱ在定向细胞迁移中起着重要作用。在人胚胎肺成纤维细胞迁移中的作用，这些细胞以固有的方式定向持续迁移。NMMHCⅡA基因敲除细胞迁移不稳定，但迁移方向基本保持不变。其通过维持前区稳定的突起来引导迁移，这些独特功能可能促进正常人成纤维细胞的内在和定向迁移^[14]。

以上的研究均表明NMMHCⅡA在细胞迁移中起非常重要作用，与癌症的发生与发展息息相关。

2．参与血栓形成、血栓性疾病以及心血管疾病

NMMHCⅡA在血小板收缩现象、血栓形成中具有非常重要的作用，其突变会增加出血倾向，还有可能与心血管疾病有关^[5]。有报道发现，NMMHCⅡA与其相互作用蛋白参与血栓性疾病，阻断这些蛋白质与蛋白质之间的相互作用有可能成为治疗这类疾病的有效策略^[15]。李芳等^[16]研究发现抑制肌球蛋白ⅡA -肌动蛋白的相互作用，通过调节PINK1/帕金森通路和线粒体分裂来阻止体外和体内局部心肌细胞凋亡和心肌缺血再灌注损伤，可用于心血管疾病的治疗。另有研究表明，非肌肉肌球蛋白Ⅱ与血管性血友病因子（vwf）的调节有关. 肌球蛋白ⅡA作为应激性止血和血栓形成中内皮vwf分泌的生理调节因子^[17]。Komatsu Satoshi等^[18]研究发现，自主神经、内皮细胞（ecs）和血管平滑肌细胞（vsmcs）之间的细胞间通讯在通过血管收缩机制不间断调节血流中起着核心作用。这种沟通障碍与血管疾病的发展有关，如高血压、脑/冠状动脉痉挛、主动脉动脉瘤和勃起功能障碍。内膜层的ecs决定了不同内侧层vsmcs中肌球蛋白Ⅱ的刺激特异性激活模式。肌球蛋白Ⅱ在组织内的独特激活模式对血管预防血压升高十分重要。

3．参与遗传性疾病

非肌性肌球蛋白重链9基因相关疾病（non-muscle myosin heavy chain 9 related disease，MYH9-RD）是一类罕见的常染色体显性遗传病，主要包括Sebastian综合症(SBS)，May-Hegglin综合征（MHA），Epstein（EPTS）综合症和Fechtner综合症（FTNS），是类似症状的综合征群^[19-21]。该疾病具有的共同特征是出现巨血小板、血小板数目减少和出现粒细胞内包涵体三联症。部分病例表现为一系列类似于Aport综合征（Alport syndrome，APS）的病症，包括肾功能损伤、听力障碍及眼部疾患等^[22]。张淑芳等^[23]研究指出光学显微镜和电子显微镜确认了MYH-9家系患者存在包涵体；免疫荧光技术显示患者和正常人之间NMMHCⅡA在中性粒细胞中的分布有差异；MYH-9患者中性粒细胞包涵体的主要构成成份是NMMHCⅡA。

4.参与细胞的分泌

Arous C等^[24]研究表明，MLCK和ROCK是NMMHCⅡ的上游调节因子，抑制NMMHCⅡA和MLCK可以使黏着斑及胰岛素颗粒的减少，从而减少胰岛素的分泌，相反抑制ROCK途径可以产生大块黏着斑，增加胰岛分泌。可见NMMHCⅡA在胰岛分泌功能调节中具有调节作用，并可以推测MLCK与ROCK具有相反作用。另有研究发现，NMMHCⅡ对HIPSC向胰腺内皮细胞分化具有抑制作用^[25]。

5.参与囊胚的形成

郭峥^[26]通过研究小鼠胚胎早期发育过程中非肌肉肌球蛋白Ⅱ的功能得出抑制非肌肉肌球蛋白Ⅱ后会阻滞小鼠囊胚的发育并降低干性相关基因的表达。另有研究发现，抑制NMMHCⅡATP酶活性会阻滞小鼠囊胚的体外发育,并降低干性相关基因的表达^[27]。Jennifer Zenker等^[28]研究发现，肌动蛋白环的结合触发局部肌球蛋白Ⅱ的积聚，并沿着连接点启动一个依赖于张力的拉链机制，这是囊胚形成所需的密封胚胎的机制。

6.参与细胞形态的形成与变化

Smith Alyson S等^[29]研究发现，NMⅡ通过与短F-肌动蛋白在Spectrin-F-肌动蛋白网络中的收缩相互作用来控制特殊的膜形态和力学性能的一般功能。另有研究发现，RHO相关螺旋蛋白激酶（RHO激酶或ROCK）是迄今为止大多数动物细胞肌动蛋白组织和动力学的明确决定因素。ROCK的主要效应器之一是非肌肉肌球蛋白Ⅱ。ROCK的活化导致肌球蛋白Ⅱ的收缩性增加，随后肌动蛋白结构和细胞形态发生变化^[30]。

7.参与细胞黏附

Efimova Nadia等^[31]研究发现，粘附连接（AJS）是基于机械敏感性的钙黏蛋白的细胞间粘附，其与肌动蛋白细胞骨架相互作用，在细胞连接处承担大部分机械负荷。产生推力的Arp2/3复合依赖性肌动蛋白聚合和产生拉力的非肌肉肌球蛋白Ⅱ依赖性收缩对AJS形态形成都是必要的。NMII抑制后，钙粘蛋白从间隙边缘消失。AJS的肌动蛋白细胞骨架是一个动态的推拉系统，推力维持细胞外钙黏蛋白的相互作用，而拉力稳定细胞内的粘附复合物。另有研究表明，上皮细胞的小带粘附（ZA）是细胞间粘附的一个部位，在这里细胞的力量被施加和抵抗。在ZA的E-钙粘蛋白粘附分子有助于感觉到施加在连接处的力，并协调细胞骨架对这些力作出反应。肌球蛋白IIA可以抑制ZA的振荡运动^[32]。

8．讨论

考察相关文献可知，近来国内外对NMMHCⅡA的研究主要集中在其与各疾病之间的关系，其中多为关于癌症的关系，但对NMMHCⅡA内皮条件性敲除前后的代谢物变化研究甚少。因此将对NMMHCⅡA在小鼠体内代谢物的变化规律进行研究，运用代谢组学的方法通过对代谢物变化的分析来得出有关NMMHCⅡA的作用机制，为诊断疾病、筛选生物标记物以及研发新药等提供理论依据。

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学生签名： 年 月 日

指导教师意见：

指导教师签名： 年 月 日

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