还原敏感型siRNA/纳米粒复合物经肿瘤细胞摄取机制的研究文献综述

还原敏感性siRNA纳米复合物入胞机制的研究

研究背景

纳米给药系统不仅要使其在靶部位浓集,还需保证将药物递送到胞内的作用靶点，并且防止其在胞外裂解释药，才能发挥有效的疗效。虽然保证纳米粒系统具有合适的粒径和电位从而避免调理素和脂蛋白的作用及被RES系统吞噬是药物靶向的重要条件,但是如果纳米给药系统不能以合理的方式到达细胞内的靶部位,并且有效释放药物,同样不能发挥很好的疗效[1]。靶向纳米颗粒到达靶组织/靶器官后可在胞外释放药物,使药物以游离方式入胞或携带药物直接进入细胞,在胞内靶点适时地释放药物。前一种传递方式的关键在于给药系统的释放药物特性,胞外药物释放行为和其稳定性药量最终决定了药效。而后者给药系统的入胞过程涉及入胞方式、胞内转运、药物的胞内释放、细胞外排等复杂的细胞处理过程,是药剂学载体研究中需要继续探索的重要内容[2]。大多细胞主要以内吞的方式对外源性纳米粒子进行摄取,而内吞主要分为网格蛋白介导的内吞(clathrin-mediatedendocytosis)、细胞膜穴样凹陷介导的内吞(caveolae-mediatedendocytosis)、大胞饮和非网格蛋白-细胞膜穴样凹陷依赖的4种内吞等[3]。氯丙嗪(CPZ)特异性抑制网格蛋白介导的内吞,非律平(Filipin)小窝蛋白内吞通道的特异抑制剂[4]。已有文献表明关于PEI-PLGA纳米粒可以携带药物以内吞的方式进入细胞发挥作用等[5]。但同时纳米粒的种类、表面电荷、物化性质等因素都会影响甚至改变细胞的内吞途径,改变纳米给药系统在胞内的分布和在溶酶体中的转运过程,从而影响胞内靶点处的药物浓度[6]。同时,细胞内吞效率、细胞消除、胞内药物释放也受载体因素的影响[7]。

前期实验

基因给药载体构建中面临各种困难，包括载体在血液中的不稳定性、低细胞摄取率、和较少的溶酶体逃逸以及在细胞外液中的分解，为了解决这些困难，提高载体进入肿瘤细胞的摄取率，并且进入细胞后在靶部位及时裂解释放药物发挥药效，首先要提高载体包裹或吸附基因的稳定性，所以近几年阳离子聚合物(PEI、PLL、PAMAM)由于能有效吸附基因而应用广泛等[8]，本课题选择PEI阳离子聚合物作为载体材料，聚乙烯亚胺（PEI）作为一种新型优良的基因载体,为质子海绵，可以吸附负电荷的siRNA，并阻止酶对siRNA的降解等[9]，有文献表明支链的PEI比直连的PEI转染效率要高等[10]，随分子量的增大毒性增大等[11]，经许多研究表明:PEI本身具有较强的细胞毒性，不适用于直接利用。还原型谷胱甘肽（GSH）是动物细胞内含量最丰富的含有巯基的生物小分子，高的GSH浓度保持了细胞内一个较强的还原性能[12]。制备还原环境敏感型纳米颗粒的方式是在材料中引入二硫键，以二硫键作为还原环境刺激-响应的开关。二硫键在细胞外环境下稳定存在，而在细胞内的还原环境下发生断裂，并且这种二硫键/巯基的转化是可逆的。结合二硫键的此特性与细胞内外的还原性差异，可以设计出不同类型的还原环境敏感型载药纳米颗粒。研究发现，肿瘤组织比正常组织有更高的还原性，其GSH浓度比正常组织至少高4倍等[13]。因此可以设计特定的还原环境敏感型载药纳米颗粒即在PEI中引入二硫键，利用细胞内外存在的显著还原性差异使二硫键/巯基可逆的转化作为触发细胞内药物释放的开关。

本实验前期已经完成的实验内容如下：以N，N-胱胺双丙烯酰胺（CBA）作偶联剂合成二硫键交联的聚乙烯亚胺（PEI-SS），并采用核磁共振波谱法（1H-NMR）和凝胶排阻色谱法（GPC）对其进行结构表征等[14]。用合成的（PEI-SS）和亲脂性材料PLGA通过超声乳化-溶剂挥发法制备PLGA-PEI-SS阳离子纳米粒，通过改变处方中PLGA与PEI-SS的比例及稳定剂种类和比例优化处方和制备工艺。试验最终确定采用Poloxamer和PVA作为稳定剂制备纳米粒，对制备的纳米粒从外观、粒径、Zeta电位、细胞毒性方面进行质量评价，外观呈现蓝色有乳光澄清透明状态，粒径位于100nm-130nm之间，电位可达到 10mV，采用琼脂糖凝胶电泳方法从以下几个方面对PLGA-PEI-ss-siRNA复合物进行质量评价：PLGA-PEI-ss与siRNA结合能力、抗核酸酶降解能力、肝素解离和还原敏感性，并与PLGA-PEI纳米粒进行比较，并前期通过细胞MTT实验、细胞转染实验和凋亡实验证明PEI-ss（0.09:1）毒性不大，并且转染效率比PEI纳米粒有明显的增加。基于以上的实验结果，继续进行本课题的细胞机制探究。

研究目的

制备PEIss-PLGA和PEI-PLGA纳米粒,并进一步研究比较其胞吞机理以及粒径、电荷对其摄取的影响。

研究内容