新型GLS1抑制剂的设计合成及活性研究文献综述

一、课题背景

谷氨酰胺（Glutamine，Gln），又称 2-氨基-4-氨甲酰基丁酸，是机体中最丰富的氨基酸。转运至细胞后，谷氨酰胺为合成各类氨基酸，蛋白质，核苷酸及其他重要生物分子提供前体物质和能量，并提供NADPH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）和GSH（谷胱甘肽）以维持细胞内氧化还原稳态。因此，谷氨酰胺与细胞生长增殖密切相关。与正常组织相比，谷氨酰胺在肿瘤细胞中的含量明显偏高且消耗快速，这一现象引起研究人员极大的兴趣。研究表明，限制谷氨酰胺代谢能有效抑制肿瘤细胞的生长。

谷氨酰胺酶（Glutaminase，GLS）在谷氨酰胺代谢中起着至关重要的作用。谷氨酰胺进入细胞后，绝大部分由谷氨酰胺酶转化成谷氨酸和氨。谷氨酸进一步被氧化成alpha;-酮戊二酸给TCA循环提供营养物质，包括 ATP，核苷酸，氨基酸，脂类等。Lora 等人发现谷氨酰胺酶活性与恶性肿瘤及正常细胞的生长速率呈正相关。谷氨酰胺缺乏或谷氨酰胺酶的抑制均能达到抑制肿瘤细胞生长的目的，已有报道谷氨酰胺酶的某些特异性抑制剂能成功诱导癌细胞死亡。以谷氨酰胺酶反义 mRNA转染艾式腹水癌细胞，发现其细胞形态发生变化且癌细胞生长受到抑制，将反义mRNA转染的癌细胞接种到小鼠体内发现癌细胞失去致癌能力。另一方面，谷氨酰胺酶的活性受癌基因MYC，抑癌基因p53的影响，进而表明谷氨酰胺代谢与恶性肿瘤的发展存在一定关系，这一发现为靶向谷氨酰胺代谢治疗癌症提供了理论基础。GLS 存在两种形式:一种是由GLS基因编码的肾型谷氨酰胺酶 ( GLS/KGA/GAC) ，一种是 GLS2 基因编码的肝型谷氨酰胺酶( GLS2/LGA/GAB)。虽然，GLS1 与 GLS2 序列高度相似; 然而，与 GLS2 主要分布于肝脏不同，GLS1 广泛分布于不同组织，并可被谷氨酸抑制。因此，提示 GLS1 可能与许多肿瘤相关。

1. 要解决的问题

谷氨酰胺依赖是肿瘤细胞的重要代谢特点，谷氨酰胺酶(GLS) 催化谷氨酰胺生成谷氨酸的反应，是谷氨酰胺酵解的第一个代谢酶。GLS 可分为肾型谷氨酰胺酶( GLS1) 和肝型谷氨酰胺酶(GLS2) 大多数肿瘤中 GLS1 高表达，GLS2 低表达。 GLS1 具有“促癌效应”，而 GLS2 具有“抗癌效应”。 GLS在多种肿瘤的发生发展过程中起重要作用． GLS 对肿瘤的诊断、进展及预后评估均具有十分重要的意义。GLS1 是肿瘤代谢治疗的潜在靶点，其特异性抑制剂有望成为新型的抗肿瘤代谢药物。本次研究设计了一系列的全新骨架结构的化合物，期望能得到活性更好，选择性更强的化合物，期望能通过后期的药理实验进一步证实GLS1抑制剂在抗肿瘤领域的重要作用。

1. 可行性分析

根据对GLS的晶体结构和底物-酶复合物晶体结构的分析，清楚的认识了底物的结合口袋。同时也得到Glu的结合口袋，谷氨酸结合口袋主要由来自延伸螺旋结构域的残基组成。Asn335和Tyr414与结合的谷氨酸alpha;-羧酸酯形成氢键，Glu381和Tyr249与结合的谷氨酸alpha;-氨基形成氢键，Tyr249位于中心alpha;/beta; 结构域的延伸环上，该残基位置表明其可能在催化反应时被用作酸。结合谷氨酸的gamma;-羧酸酯与Ser286的侧链羟基以及其主链酰胺形成氢键Ser286在与带有反应性基团的抑制剂具备共价修饰的作用。在结合谷氨酸的gamma;-羧酸酯和alpha;/beta; 结构域的Tyr466之间可能存在长且较弱的氢键。由于Glu也可抑制GLS1的活性，固为GLS1抑制剂的设计提供的结合靶点。其次，根据前人合成的GLS1抑制剂如阿西维辛、DON、小分子968、Bis-2-（5-phenylacetamido-1，2，4-thiadiazol-2-yl）ethyl sulfide（BPTES）、CB-839、2-苯基-1，2-苯并异硒唑-3（2H）-酮（依布硒啉）等，它们都具有较好的抑制活性，并且具有特定的结合位点，为新型抑制剂的设计提供了更多的位点选择。

另外，如何评价一个抑制剂的活性也是至关重要的，GLS1的活性指标能间接反映出抑制剂的活性大小，所以如何检测GLS1的活性是关键。进来发展出如下的一些方法来检测GLS的活性，都具有较高灵敏度。

1．邻苯二甲醛显现法 使用邻苯二甲醛巯基乙醇试剂检测反应生成的氨。将谷氨酰胺酶与100mM磷酸钾，171m谷氨酰胺，1.5mM氯化铵和10％乙二醇的混合物（pH8.0）于37℃孵育30分钟，以10mu;l7％三氯乙酸终止反应，冰上保持15分钟后离心，与邻苯二醛-巯基乙醇试剂避光置于反应45分钟，用分光光度计测定410nm吸光度值。邻苯二甲醛显现法原理是：邻苯二甲醛的醛基和氨基酸、多肽、蛋白质或氨基葡萄糖等含氨基的等含氨基的化合物，在碱性（pH9.5）和强还原剂（如硫基乙醇）存在的条件下，醛基和氨基结合生成西夫碱，在波长350-340nm紫外光激发下，可发出450-455nm波长的可见光。

2. NAD（P）H-NADP）法 NAD（P）H为指示系统和色素原底物测定谷氨酰胺酶活性，此反应方法分两步进行。20mM谷氨酰胺被谷氨酰胺酶催化成谷氨酸，37℃孵育10分钟后以3NHCl终止反应；加入NAD（P） ，ADP，hydrazine，脱氢酶，将反应生成的谷氨酸由谷氨酸脱氢酶转化成alpha;-酮戊二酸和氨，同时使NAD（P） 还原成NAD（P）H，检测340nm处吸收峰。反应原理是：NAD（P）H在340nm处有一吸收峰，而NAD（P） 在此波段毫无吸光性。

3. 谷氨酸氧化酶偶联法 谷氨酰胺酶催化谷氨酰胺生成谷氨酸，谷氨酸进一步被谷氨酸氧化酶转化成酮戊二酸，氨和H2O2。Zhang等利用辣根过氧化酶催化H2O2和AmpliteTMred生成荧光产物，其在530-570nm激发光条件下，发射出590-600nm波长的可见光。ByronDeLaBarre等利用辣根过氧化酶催化H2O2和刃天青生成试卤灵，试卤灵在波长544nm激发光下，发射出590nm可见光。

1. 研究方法和内容

本次毕业设计将进行一系列的化合物的设计合成，基于虚拟筛选的结果，参考现在临床研究中的两个化合物CB839和BPTES的结构进行了合理药物设计，设计了以下一类骨架的化合物。通过文献查阅初步定下了合成路线，本次研究将围绕着以下一系列化合物的合成展开。