表观重组对基因组印记的影响文献综述

一、选题目的及意义

基因组印记是一种高等植物和哺乳动物中由亲本来源决定的单等位基因表达的现象。这一过程是通过表观遗传修饰使两条亲本染色体上出现差异实现的。它在哺乳动物发育过程中有不可或缺的作用。印记基因调控失常会导致癌症，糖尿病，心血管病和神经性疾病等许多人类疾病。我们实验室的研究表明ZFP57蛋白在胚胎干细胞和诱导干细胞中同样维持印记基因的遗传和正常表达(Zuo, Sheng et al. 2012, McDonald, Liu et al. 2016)。胚胎干细胞和诱导干细胞是最有可能将来被用于老年痴呆症等人类衰退性疾病的细胞治疗中的。与胚胎干细胞一样，iPS细胞能够自我更新并维持分化状态，而且能避免干细胞研究领域的免疫排斥和伦理道德问题。在体外iPS细胞可以定向诱导分化出多种成熟细胞，因此，iPS细胞在理论研究和临床应用等方面都极具应用价值。印记基因的非正常表达会引起很多疾病，如Prader-Wiill综合征、愉快木偶综合征、Silver-Russell综合征等。而印记基因的遗传在这些干细胞中又很不稳定，比如说会在一些印记控制区域发生甲基化的丢失，导致印记基因失去单等位基因表达的性质。印记的维持是很复杂的机制，但已经发现了一些调控因子（如ZFP57蛋白）可以调控印记的维持。所以我们希望了解在小鼠的诱导多能干细胞（iPS）生成过程中基因组印记是如何维持的，并通过对ZFP57蛋白的研究发掘它在iPS中维持印记标记的目标印记基因群区和对应的分子机理。这将为获得有稳定印记基因遗传并适合将来用于细胞治疗的胚胎干细胞和诱导干细胞打下基础，具有重大意义。

为了分析鉴定ZFP57蛋白在iPS细胞中维持基因组印记的目标区域，我们将从携带有单核苷酸多态性(SNPs)具有两种遗传背景的杂交MEF细胞中获得多个iPS克隆。然后用联合亚硫酸氢盐限制分析检测这些iPS克隆中的多个位点DNA甲基化印记标记。此外，我们还将进行等位基因特异性RT-PCR分析，以确定Snrpn和Zim1等印记基因在iPS细胞及其后代中是否保持单等位基因表达的特性。我们预期获得的研究结果可能对将来iPS细胞治疗应用有一定的指导意义。由于在某些iPS克隆中，DNA甲基化印记可以在多个印记区完全消除，因此iPS细胞重新编程也可以用来剖析哺乳动物基因组印记的维持、擦除和再获取等潜在机制。

二、本课题主要研究内容（提纲）

1. 获得带有单核苷酸多态性(SNPs)具有两种遗传背景的Zfp57杂合子以及纯合突变体的小鼠胚胎。

2. 将能表达OCT4、SOX2、KLF4和MYC四种蛋白质的MEF细胞诱导成iPS细胞。

3. 筛选出诱导成功的iPS细胞并扩增培养。

4. 从iPS细胞中提取基因组DNA和总RNA样品。

5. 对基因组DNA进行亚硫酸盐测序、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析和对总RNA进行等位基因特异性RT-PCR分析，从而了解ZFP57蛋白对小鼠基因组印记维持情况以及印记基因表达情况的影响。

三、国内外研究情况及发展（文献综述）

目前已在小鼠中确定了大约150个印记基因(Lee and Bartolomei 2013)。印记基因通常存在于由顺式作用的印记控制区(ICR)调控的簇中，ICR的长程效应可跨越上百万碱基。该区域在雄性或雌性生殖系中的父本或母本的等位基因上的CpG位点上获得可遗传的亲本特异性差异DNA甲基化（DMR）。DMR的缺失或去甲基化都可能导致此簇中所有印记基因异常表达。一个印记基因簇可以含两个到几十个印记基因，而印记基因在簇中常分散分布(Li 2013) 。ICR的甲基化周期始于原始生殖细胞发育过程中甲基化的消除。随后，在卵子发生和精子发生过程中，母本和父本染色体上的差异甲基化又被重新建立。受精后，植入前胚胎的基因组会发生主动和被动去甲基化，大量的甲基化会被消除，随后，新的甲基化大约在胚胎植入期重新获得。然而，生殖细胞印记似乎对这种受精后甲基化重编程具有抵抗力，使它们能够从生殖细胞稳定遗传到后代。对从头合成DNA甲基转移酶和维持DNA甲基转移酶的基因突变的研究已经证明，生殖细胞印记的建立和受精后差异甲基化的维持，对于印记基因单等位基因地表达是必不可少的(Li, Ito et al. 2008)。

在iPS中观察到了高频率的遗传和表观遗传异常，如拷贝数变异（包括亚染色体重复和缺失），编码蛋白质的基因突变，以及印记区域和X染色体失活区域DNA甲基化缺陷。虽然尚不清楚这些异常表观遗传标记是否反映了在重编程过程中出现了错误或是多潜能逆转得不完全，但它们可能会影响体外疾病建模的准确性，更重要的是会影响到iPS细胞在再生医学中的应用。(Ma, Morey et al. 2014) Nazor, Altun等人发现，一些特定的组织类型中具有DNA低甲基化的特征，而组织特

异性的低甲基化的基因与该组织的功能相适应(Nazor, Altun et al. 2012) 。由于iPS细胞的传代培养中基因组印记丢失的情况没有显著增加，所以导致iPS细胞中亲本基因组印记丢失的原因可能在iPS细胞衍生的重编程过程中(Takikawa, Ray et al. 2013)。诱导多能干细胞（iPS）的产生主要是一种表观遗传重编程过程，这一过程是快速和随机的。体细胞可以通过表达Oct3/4, Sox2, c-Myc，Klf4四种转录因子进行重编程，从而被诱导成多能干细胞。不同的多能干细胞衍生方法，会引起基因印记的丢失丰度不同，而不同印记区域印记的保留情况也不相同(Bar, Schachter et al. 2017)。而印记标记的缺失会引起印记基因表达异常和胚胎发育缺陷。关于iPS中的基因组印记标记的丢失情况，很多实验室都进行了大规模、全基因组的分析(Bock, Kiskinis et al. 2011, Chang, Gao et al. 2014, Bar, Schachter et al. 2017)，Bock等人建立了用于快速综合地评价多能细胞系特性的打分卡， (Bock, Kiskinis et al. 2011)，对于实验人员如何根据研究内容选择多能细胞系具有重要的指导意义。

在基因组印记的建立与维持中，ZFP57蛋白是一个主要的调节因子，它通过KAP1招募DNA甲基转移酶来维持基因组中的甲基化印记(Zuo, Sheng et al. 2012)。KRAB锌指蛋白是小鼠和人类基因组中最大的转录因子家族之一。它们通过KRAB盒介导的与KAP-1/TIF1beta;辅助因子结合，然后再招募DNA甲基化转移酶来维持印记标记。我们实验室还发现ZFP57蛋白的缺失会造成心脏发育的缺陷(Shamis, Cullen et al. 2015)，并且母本的和合子的Zfp57基因产物具有互补但不重叠的作用。人的ZFP57蛋白在小鼠ES细胞中可以替换小鼠的ZFP57蛋白维持许多印记区域的基因组印记(Takikawa, Wang et al. 2013)。所以小鼠和人的ZFP57蛋白维持基因组印记的作用机制很可能是相同或相似的，研究小鼠的ZFP57蛋白，对于阐明人类基因组印记的维持机制具有重大意义。也对iPS未来的临床应用具有一定的指导意义。

四、拟解决的关键问题

1. 对比分析不同印记区域的印记保留情况，并找出其中的规律。

2. 提高iPS的制备效率，了解体细胞重编程的分子机制。

3. 获得有稳定基因组印记的iPS，减少iPS细胞移植后的癌变风险和其它发育缺陷，使其能更好地应用于将来的细胞治疗。

五、研究思路和方法

为了观察ZFP57蛋白对基因组印记的影响，我们希望得到三种基因型的小鼠胚胎， Zfp57 ^/-(M Z )、Zfp57^-/-z(M Z^-)和Zfp57^-/-mz(M^-Z^-)。其中，Zfp57 ^/-(M Z )是Zfp57基因的杂合子，它的母本和合子中都含有ZFP57蛋白，而Zfp57^-/-z(M Z^-)是Zfp57基因的突变纯合子，它只在母本中含有ZFP57蛋白，不过合子中起初有受精时卵子中带来的ZFP57蛋白，但随时间推移合子中的ZFP57蛋白被稀释掉了，最后，Zfp57^-/-mz(M^-Z^-)也是从纯合突变的小鼠胚胎中取得的小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞，但它在母本与合子中都没有ZFP57蛋白。这三种细胞互为对照，从而帮助我们理解ZFP57蛋白的作用。我们会首先进行Zfp57小鼠的定时交配，以得到Zfp57杂合子以及纯合突变体的小鼠胚胎。从E12.5-14.5的小鼠胚胎中获得MEF细胞，用多西环素诱导细胞使其表达Oct3/4, Sox2, c-Myc，Klf4四种转录因子，这将诱导细胞进行重编程，使其成为iPS。对得到的iPS进行筛选并扩增培养，提取DNA、RNA。对DNA进行亚硫酸盐测序、联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法（COBRA），分析DNA甲基化印记，利用两个DMR中的单核苷酸多态性，确定其亲本来源。对总RNA进行等位基因特异性RT-PCR分析，以确定是否存在单等位基因表达。从而阐明ZFP57蛋白对小鼠iPS基因组印记的影响。

六、本课题的进度安排

1. 129/DBA2小鼠杂交实验、取得胚胎：四周。

2. 获得MEF细胞，传代培养：二周。

3. iPS单克隆细胞培养及筛选：四周。

4. COBRA：一周。

5. 重亚硫酸盐测序：二周。

6. 数据分析，编写报告：一周。

七、参考文献

Bar, S., M. Schachter, T. Eldar-Geva and N. Benvenisty (2017). 'Large-Scale Analysis of Loss of Imprinting in Human Pluripotent Stem Cells.' Cell Rep 19(5): 957-968.

Bock, C., E. Kiskinis, G. Verstappen, H. Gu, G. Boulting, Z. D. Smith, M. Ziller, G. F. Croft, M. W. Amoroso, D. H. Oakley, A. Gnirke, K. Eggan and A. Meissner (2011). 'Reference Maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines.' Cell 144(3): 439-452.

Chang, G., S. Gao, X. Hou, Z. Xu, Y. Liu, L. Kang, Y. Tao, W. Liu, B. Huang, X. Kou, J. Chen, L. An, K. Miao, K. Di, Z. Wang, K. Tan, T. Cheng, T. Cai, S. Gao and J. Tian (2014). 'High-throughput sequencing reveals the disruption of methylation of imprinted gene in induced pluripotent stem cells.' Cell Res 24(3): 293-306.

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Zuo, X., J. Sheng, H. T. Lau, C. M. McDonald, M. Andrade, D. E. Cullen, F. T. Bell, M. Iacovino, M. Kyba, G. Xu and X. Li (2012). 'Zinc finger protein ZFP57 requires its co-factor to recruit DNA methyltransferases and maintains DNA methylation imprint in embryonic stem cells via its transcriptional repression domain.' J Biol Chem 287(3): 2107-2118.