构建MSLN表达载体及体外转染人乳腺癌细胞的研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1. 选题目的、意义及研究现状
2. 选题目的

构建MSLN表达载体，并将该载体在体外转染人乳腺癌细胞，检测转染后细胞的稳定转染情况，为后续开展抗乳腺癌疗法研究提供必要的材料和相关方法。

1. 选题意义

开展构建MSLN表达载体及体外转染人乳腺癌细胞的研究可提升学生对于MSLN和人乳腺癌等的深入了解，加强学生对于CAR-T细胞治疗的技术应用，提高学生在细胞培养、载体构建及细胞转染等方面的实验操作水平。若实验成功构建表达MSLN的人乳腺癌细胞，则可为人乳腺癌的治疗提供一定的参考价值。除此之外，通过毕业设计，可以提高学生调研、分析资料、处理数据等能力。

1. 研究现状

虽然恶性肿瘤已进入免疫时代，但实体瘤如乳腺癌等肿瘤疾病的治疗依旧不尽如人意。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率已高居女性恶性肿瘤之首，死亡率也位于前列，全世界每年有138万女性发病以及超过45万女性死于乳腺癌^[1]。现如今，肿瘤免疫学发展迅速，嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T cell,CAR-T细胞)免疫治疗在白血病、淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤治疗上取得了较大的成就，显示出了较好的应用前景。相比于化疗和靶向治疗，CAR-T细胞免疫治疗具有更长效控制肿瘤生长的潜力，且不良反应较少。近年来，CAR-T在实体瘤方面也取得了不错的进展，这就为进一步提高乳腺癌综合治疗效果，研发更高效低毒的CAR-T细胞免疫治疗提供了研究方向^[2]。

CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区和T细胞信号传导区连接而成，CAR-T细胞技术主要是体外分离T细胞，再通过基因转导的方法转染T细胞，使其表达CAR-T并通过主要组织相容性复合体非限制的方式直接特异性识别肿瘤表面抗原，使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应^［3］。 CAR-T细胞经过20多年的发展，至今已发展到第四代 ^[4]。 1代CARs仅有一个胞内信号分子，它虽然能识别肿瘤细胞，但只能引起短暂的 T 细胞增殖和较少的细胞因子分泌，临床效果有限． 2代CARs是在1代的基础上添加1个共刺激分子(如CD28、CD137) ，明显提高了CAR-T细胞的抗肿瘤活性；3 代CARs则在胞内添加了2个串联的共刺激分子，研究显示3代CAR-T细胞的增殖能力和杀伤活性都得到了进一步的提高；研究人员目前正在进行4代CAR技术的研究，4代CARs也被称为精准CAR-T细胞，这一代的CAR-T细胞设计主要是从肿瘤等疾病的精准治疗角度考虑，即应用编码CARs和(或)CARs反应性启动子的载体构建CARs，在细胞因子的作用下CARs产生有效的信号，而这些细胞因子还可招募免疫系统的其他成分使抗肿瘤免疫效应放大^[5]。

肿瘤相关抗原--间皮素（Mesothelin，MSLN），是一种由71-kDa的前体成熟转变成的40-kDa糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，存在于细胞表面^[6]。MSLN，在间皮瘤、非小细胞肺癌、食道癌和转移性三阴性乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达，在正常组织中不表达或间皮组织中低表达，而成为备受关注的肿瘤细胞特异靶向抗原。此外，有研究报道MSLN可促进肿瘤恶性表型形成，MSLN阳性的患者肿瘤预后更差，在正常胸膜，腹膜，心包膜等间皮组织中MSLN的表达较少。因此，以间皮素为靶点来构建CAR-T为免疫细胞提供了一个安全的选择^[7]。MSLN也是三阴性乳腺癌特征性标志物，而三阴性乳腺癌对单抗药物几乎无敏感性，MSLN CAR-T细胞有望成为三阴性乳腺癌仅有的免疫治疗药物^［6］。MSLN靶向的CAR-T细胞最早是在2011年，由Beatty等利用电转mRNA的方式制备，这种通过mRNA短暂表达CAR分子的CAR-T细胞较大地降低了CAR-T细胞对正常组织的风险性，他们也在后续的Ⅰ期临床试验中证明了这种设计的安全性和持续性^［8］。当前，多项MSLN CAR-T细胞的临床试验正在进行，探索不同的转导方式和联合治疗模式对于MSLN CAR-T细胞效力的影响。

流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有高效、快速、精准、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定性和定量分析技术之一 ^{[ 9-10]} 。近年来，FCM迅速发展，新技术不断突破，新仪器不断涌现,FCM基于其独特的细胞分选原理和强大的荧光标记技术，在CAR-T细胞治疗过程表现出显著的优势。随着流式细胞术的迅速发展，其广泛应用于CAR-T细胞治疗的各个环节，流式细胞术不仅在CAR-T细胞制备的初始T细胞获取和富集、体外激活和扩增、表型质控和释放试验等多个环节进行优化，也在治疗前患者筛查和回输后体内监测、MR检测方面也发挥着重要作用。

1. 研究方案及预期结果

主要研究内容：

（1）人乳腺癌细胞细胞系的培养；