拟南芥bHLH基因Cas9突变体敲除突变体表型鉴定文献综述

文献综述

课题研究现状

拟南芥其基因组大约为12500万碱基对和5对染色体，是目前已知的高等植物基因组中第二小的，其测序工作已于 2000 年完成^[1]，因此其作为模式植物广泛应用于植物学研究。

碱性/螺旋－环－螺旋 (bHLH) 转录因子家族是一个在动植物中广泛存在的基因家族，从Murre 等人于1989 年发现了 bHLH (basic/helix-loop-helix，碱性/螺旋-环-螺旋)结构^【2】以来，研究者们已经在真核生物中发现了许多 bHLH 转录因子超家族成员。bHLH 结构域是一个转录因子特有的结构域。这个结构域的基序包含了约 60个氨基酸，由一个碱性氨基酸区 (basic region)和一个螺旋-环-螺旋 (HLH region)区组成^【2】。在碱性区约含 15 个氨基酸，其中含有较多的碱性氨基酸，这个区域的活性主要与转录因子与 DNA 特定序列的结合有关。螺旋-环-螺旋区的主要作用是与其他蛋白结合形成二聚体，协同行使功能。据研究表明，bHLH基因在单、双子叶植物中有66个以上的共同祖先，这说明在植物的祖先中，bHLH 基因家族已经具备一定的规模，更显示这个基因家族在功能上的重要性。同时，进化分析表明这个基因家族在进化过程中，伴随染色体复制事件而发生了多次的扩增，同时，可能由于功能的冗余或者非致死突变的积累，某些 bHLH 家族成员逐渐失去原本功能成为假基因。尽管同时发生了基因的复制和消亡，但由于复制产生新基因的速率大大超过了基因消亡的速率，因此 bHLH 基因家族在进化过程中规模不断扩大，使其成为了植物中第二大的转录因子家族^【2】。尽管该家族成员庞大且大多在植物的生长过程中起重要作用，但目前对植物中该家族的研究较少，我们通过对拟南芥中的相关基因进行研究，找到拟南芥中与其他经济植物之间相似的功能，以此来提升植物的营养及经济效益等^【3】。

CRISPR/Cas9 技术在植物中最早运用于拟南芥，其工作原理是当病毒或噬菌体入侵细菌时，会被体内的CRISPR系统切割成小的 DNA 片段(Protospacer)，并被整合到细菌的间隔序列之间(spacer)，当噬菌体再次入侵时，细菌体内 CRISPR 位点在 RNaseⅢ、tracrRNA 和Cas 蛋白的作用下形成含有与外来 DNA 小片段互补的 crRNA，crRNA 与 tracrRNA 组成 crRNA-tracrRNA的向导 RNA(single guide RNA, sgRNA)，sgRNA 引导核酸酶 Cas9 蛋白切割与 crRNA 互补的外源双链DNA，从而达到对抗噬菌体感染的目的^【4】。这一点特别适用于功能基因组的研究，可以有意识的在同一时间对多个特异基因/位点进行编辑或敲除以研究其功能和相互关系，不但规避了之前 T-DNA 插入、EMS 处理创造突变的随机性，而且单一个体多突资源为功能冗余基因的研究以及多倍体物种的研究提供了强大助力，更因其方法简单,适用于高通量研究的特点，基因组编辑技术被广泛应用，不容置疑的开启了基因功能研究的新纪元^【5】。同时根据以往的研究表明CRISPR/Cas9 技术可以对双子叶作物(拟南芥, 烟草, 大豆等)以及单子叶作物(水稻,玉米, 小麦等)进行高效的基因编辑，经过编辑后的基因或者是突变表型遵循孟德尔的遗传定律，能过稳定的遗传给下一代。

维生素C，又名抗坏血酸是植物体内主要的抗氧化物质，存在于大多数植物绿色组织中在植物的生长和代谢过程中起着重要作用，同时也是人类自身无法合成，需要从外界摄取的微量元素。植物中AsA的重要性不仅在于它为不能正常合成AsA的少数动物(包括人类)提供丰富的维生素C源;并且经过近年来的研究发现，AsA对于植物自身的光合保护、抗氧化作用以及调节生长发育等都具有非常重要的生理功能^【6】。植物合成抗坏血酸从头合成主要通过Smirnoff-Wheeler途径，在光合组织中占主导地位。Smirnoff-Wheeler通路的两个中间体，gdp - d甘露糖和gdp - l半乳糖，也是植物细胞壁非纤维素成分的前体^[6]。因此，更好地理解抗坏血酸的生物合成和调控是产生没有发育副作用的改良果实的关键。这可能涉及一个未知的严格调控，使植物生长和发育，而不损害细胞氧化还原状态的调节抗坏血酸池。在某些水果和发育条件下，d -半乳糖酸盐的另一种途径也可能是相关的^[7]。有关AsA生理功能和在植物体内的运输机制，植物合成AsA的多条途径各基因在不同植物种类时空特异性表达，特别是某些高AsA含量植物中的合成和代谢机制、及其遗传调控等方面仍需深入研究。这都对将利用植物大规模生产AsA具有重要的应用意义。

发展趋势

总的来说，随着bHLH 基因家族在开花植物进化的过程中不断扩展，大量的表达数据分析中已有的功能研究的信息表明，bHLH 基因在植物中不同组织、不同发育时期或不同生长条件下有广泛表达，其功能也十分多样，参与了包括生长发育、生殖、抗逆等种种生理过程^[18]。产生的新成员既有功能保守的一面，又分化出了一些新的功能，而正是这些变化的积累，导致了植物表型的变化。尽管我们已知植物 bHLH 蛋白如 OsbHLH1参与了抗冷胁迫^【9，10】，AMS 参与了花药绒毡层发育，PIF 参与了光信号传导等等不同的生理过程，但这仍然只是其中的一小部分，因此通过我们研究，来为今后遗传学、分子生物学、生物化学、生理学或其他新方法研究 bHLH 基因家族提供了坚实的基础。

关于CRISPR/Cas9 系统操纵转录调控或者特定位点的染色体状态可以揭示，遗传物质在细胞中如何组织利用，阐释基因组结构及其功能之间的关系。这使得分子生物学家有能力操纵 DNA 分子，使其成为生物技术及医药领域研究改造的有力工具，进而使得利用基因为人类造福成为可能。另外，CRISPR/Cas9 系统是基因组水平的编辑，与RNAi 相较，又具有完全敲除表达、可遗传的优势^[11]。特别是用于关键基因功能研究的单基因完全敲除，通过设计替换 sgRNA，基本上所有的基因都可以被敲除^[12]，实现对其功能的研究。CRISPR/Cas9 编辑技术在促进了功能基因组研究的同时，也为农作物品种改良提供了一种新策略。其编辑的位点与转入的片段在后代中可以通过分离从而得到不含转基因成分的突变植株，在育种中有很大的应用潜力。同时现在的基因编辑技术仍存在一些问题还没有解决，在植株个体中敲入编辑还没有实现，这需要我们去寻找更加简便更加快捷的方式来解决科研问题，为造福人类打下坚实的基础。

在Vc方面通过深入研究各个基因的表达对植物生长的影响，在提高AsA含量的同时，也要保证不影响植物正常的生长发育，在此之后再对植株进行研究以期获得能够高存活高产量的植株。要兼顾旁路途径，这样可以拓宽AsA合成的前体范围，减少前体对AsA含量的限制，丰富代谢网络。最终实现填补我们所有人空缺的微量元素。