FOXO1调控MiRNA-125b表达水平的研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

研究背景和立题依据：

MicroRNA（miRNA）是一种长度约18~26bp的单链小分子RNA，miRNA基因通常是在核内由RNA聚合酶II(polII)转录的，最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(AAAAA)的pre-miRNA。pre-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的pre-miRNA。RANGTP和exportin5将pre-miRNA输送到细胞质中。随后，另一个核酸酶Dicer将其剪切产生约为22个核苷酸长度的miRNA。miRNAs也是越来越受关注的转录后调控网络（post-transcriptionalcontrol）中重要的调控因子。首先miRNA结合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）复合物中，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC），然后通过不完全的碱基互补靶向结合到目标mRNA的3UTR区或编码区，再通过引导酶切影响了mRNA的稳定性，或直接阻碍翻译过程，而导致mRNA的降解或抑制蛋白质的合成，从而在转录后水平调控基因表达。[1-2]miRNAs参与生命活动过程中一系列的重要进程，包括生长发育、细胞增殖、分化、细胞运动、新陈代谢等。[3]据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30%的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。近来研究表明，miRNA在乳腺癌发生、发展及转移中发挥重要的作用，其中miR-373、miR-21、miR-10b、miR-200c和miR-125b等均与乳腺癌转移密切相关[4-9]。

本课题组主要研究miR-125b转录后水平调控肿瘤细胞转移的分子机制，miR-125b有两个前体即miR-125b-1和miR-125b-2，他们具有相同成熟miR-125b序列，只是在成熟序列的两侧序列不同而已,且miR-125b与线虫lin-4具有很强的同源性，miR-125b-1和miR-125b-2编码基因分别位于11号和21号染色体上，miR-125b-2位于一个基因的内含子内而miR-125b-1位于一个基因的外显子中，且miR-125b与肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡、侵袭、转移都有着密切的关系，特别在细胞分化中扮演着重要的角色。Y.Mizuno在成骨细胞分化的研究中发现，miR-125b在维持间质细胞特性有很大的作用，miR-125b可以通过抑制细胞增殖从而抑制成骨细胞的分化，但是具体的机制还不是很清楚；近期的研究发现miR-125b在肿瘤转移过程中具有很大的作用，在转移能力不同的乳腺癌细胞中miR-125b的表达水平与转移能力有相关性，在Zhang等人的研究中，高转移乳腺癌细胞株MDA-MB-231比低转移MCF-7中miR-125b表达水平上升了10倍以上；Scott等[10]向乳腺癌细胞株SKBR3中转染miR-125b能显著抑制SKBR3细胞侵袭转移能力。Raffa等[11]通过对结肠癌、膀胱癌、乳腺癌和肺癌原发肿瘤病灶和相应转移的淋巴结miRNAs表达谱对比研究发现，miR-125b在转移性乳腺癌淋巴组织中低表达而在转移性结肠癌淋巴结组织中高表达，支持了Scott等研究结果，同时也说明了miR-125b参与肿瘤细胞的侵袭转移调节具有组织器官特异性，MinhT.N.Le等人报道miR-125b可以在转录后水平下调抑癌基因P53的表达水平，从而抑制细胞凋亡[12-14]。本课题组先前的研究发现miR-125b通过抑制靶蛋白STARD13表达水平，从而促进波形蛋白、纤维肌动蛋白等上皮间质转化特征蛋白，从而促进肿瘤细胞转移。

已知MicroRNAs的表达受多种转录因子控制，但目前对microRNAs转录的调控研究还不够深入。利用生物信息学软件预测发现在miR-125b的转录激活区存在转录因子ForkheadboxO1（FoxO1）结合位点。Forkhead转录因子是2000年才正式统一命名的一个新的转录因子家族[15]，从1989年在果蝇中发现第一个Forkhead基因以来，目前这个家族已超过100个成员。该家族的共同特征是具有一个长110个氨基酸的保守的DNA结合结构域，称为(Forkheadbox)结构域，折叠成3个alpha;-螺旋（helix1、2、3）和2个翅膀状（winged）的大环结构[16]，因此根据这一DNA结合结构域的特点又把这类转录因子叫做Forkhead/wingedhelix转录因子。Forkhead转录因子目前被分为17个亚家族，FoxA~Q，它们功能多样，有的目前尚不清楚。其中研究最深入的是O亚家族（FoxO）。FoxO转录因子的活性在基因转录水平、翻译后修饰、蛋白质的稳定性及蛋白质-蛋白质相互作用等多个层次上受到调节，其中磷酸化/去磷酸化和乙酰化/去乙酰化修饰在调节FoxO蛋白分子的亚细胞定位及其转录活性中起核心作用[17]。而FoxO1是FoxO亚家族的重要一员，该蛋白主要有调节细胞衰老，细胞周期，代谢及抗肿瘤作用。转录因子FoxO1通过结合到下游基因启动子而激活一系列重要基因来调节细胞的重要过程[18]。有报道发现肿瘤抑制因子FoxO1在抑制肿瘤细胞增殖能力的同时存在增强肿瘤细胞存活能力并形成耐药性[19]。Shimono,Y研究发现miR-125b在乳腺癌肿瘤干细胞中高表达，并与抗药性相关；MaximilianDiehn报道FOXO1在肿瘤干细胞耐药性研究中显著的上调表达，结合生物信息学软件分析发现在miR-125b转录激活区存在转录因子FOXO1结合位点，提示转录因子FOXO1是miR-125b转录激活潜在的调控因素。

本课题通过构建EGFP-C3-FOXO1质粒，转染乳腺癌系MCF-7细胞，通过实时荧光定量PCR等方法研究FOXO1对miR-125b表达水平的影响，在miRNAs转录调控的研究中有新的突破，也为miR-125b调控肿瘤细胞转移分子机制进一步研究提供新的思路，为抗肿瘤药物的筛选提供一定的理论依据，有着重大的科研意义。

具体实验内容：

（1）获取FOXO1基因序列，设计适宜的引物，选取合适的PCR条件，进行目的基因的扩增，PCR产物的检测，PCR产物凝胶回收；

（2）提取pCDNA3.1质粒，通过适宜的限制性内切酶（Kpn1和BamH1)和T4连接酶进行双酶切和连接，从而构建pCDA3.1-FOXO1质粒；

（3）制备大肠杆菌DH5alpha;感受态细胞及转化，获取单克隆质粒，利用脂质体Lipo-2000转染乳腺癌系细胞MCF-7和MDA-MB-231；