高通量垂直流免疫分析方法研究文献综述

1. 文献综述（或调研报告）：

高通量垂直流免疫分析方法研究文献综述

1. 课题背景：

近来，检测对于国际安全和公共健康具有潜在威胁的生物信号如病原体、病毒和毒素的标准方法主要依赖于微生物培养。这个方法很费时并且需要复杂的仪器和相关的专业操作人员。所以，研发一种快速、简单并且灵敏度高的方法去检测具有生物威胁性信号十分重要。

但是大多数的纸基设备都是利用侧流免疫检测形式，这种形式液体的流动是和纸的表面平行。这种方式通常由几种片段在基底上组装起来，并且被测液体是通过毛细管力流过这些片段。侧流免疫检测的主要好处是低耗、快速得到结果、灵活和方便使用。但是，为了达到充分的流速，纸内部的孔径大小被限制在几微米，这样的孔径大小会阻碍生物分子的捕捉并因此会限制检测的灵敏度。除此之外，侧流免疫检测还面临着样本大小的限制、多元检测的限制等多种问题。

目前一种基于垂直流免疫检测的纸芯片可以克服上述困难。这种方式在基于免疫检测的薄膜上与侧流免疫检测很像，但是，检测液体是垂直的流过薄膜而不是水平的。近几年，出现了各种关于垂直流监测分析的设计和发展。其中一种设计是以叠加的方式简单地替换传统的横向流段，然后使液体从顶部向底部扩散。另外一种方法是通过按压使试剂通过单层的薄膜，并且使靶标与相关试剂在薄膜上进行反应。这类垂直流免疫检测设备利用将具有纳米多孔结构的硝化纤维素膜封装在不锈钢过滤器支架中。当样本通过提前被捕获抗体修饰过的薄膜后，形成三明治的夹层架构并且会出现色度信号，表明了样本中含有靶抗原。不断发展的垂直流免疫检测作为检测工具在各种临床和资源匮乏的情况下检测具有生物威胁性的病原体表现出巨大的潜力。

1. 研究方法：

2.1核壳结构金属纳米颗粒的制备

利用种子生长技术制备了核壳SERS纳米颗粒。采用柠檬酸盐热还原法制备了金纳米粒子，并将其作为基底用于SERS纳米探针的制备。随后，将NBA、4-MBA和4-NBT三种拉曼染料逐滴加入AuNPs中，在磁搅拌下保持。然后，将反应体系以丢弃未结合的颗粒，并将沉积物重新悬浮在超纯水中。之后，在锥形烧杯中加入抗坏血酸，将其加入上述功能化的Au@NBA、Au@4-MB和Au@4-NBT胶体溶液中，进行磁搅拌。随后，用微量移液管将AgNO3逐滴加入上述共轭胶体中，并剧烈搅拌。由于抗坏血酸还原AgNO3，共轭溶液的颜色由紫粉色变为橙黄色，结果表明，所制备的银壳在金种子表面连续生长。在离心并丢弃上清液后，获得AuNBA@Ag、Au4-MB@Ag和Au4-NBT@Ag的核壳SERS纳米颗粒，并在相同体积的PBS中重新悬浮以供进一步使用。

2.2生物功能化核壳SERS纳米纳米探针的制备

对于PSA、CEA和AFP抗原的多重检测，采用三组不同的核壳SERS纳米标记（AuNBA@Ag、Au4-MB@Ag和Au4-NBT@Ag）对每个靶抗原进行特异性识别。首先，用K2CO3和HCL将纳米颗粒溶液的pH值调节到8.5，然后分别将AuNBA@Ag、Au4-MB@Ag和Au4-NBT@Ag溶液与PSA Ab、AFP Ab和CEA Ab混合，在37℃下孵育，然后添加BSA以阻断生物功能化SERS纳米颗粒。隔夜孵育后，对生物结合的纳米颗粒进行离心分离，以去除未结合的抗体并最小化非特异性相互作用。随后，将具有生物功能的SERS纳米探针重新悬浮在相同体积的PBS中，并储存在4℃以供进一步使用。

2.3传感制备

将NC膜裁剪成是直径约13mm的小圆片垫，放置在含95%纯乙醇的超声仪器中进行透明处理，然后贴在玻璃片上。之后，用PBS缓冲液多次清洗。随后，我们用移液管将PSA、CEA和AFP捕获抗体固定在NC膜上，形成用于多重检测的改良试验区。然后将NC膜放入摇床中37℃孵育1h，最后用BSA溶液封闭非特异性吸附位点。用PBS缓冲液洗涤三次后，将制备的传感膜储存在4℃以供进一步使用。