mGM-CSF/βhCG融合蛋白致敏的树突状细胞疫苗抗肿瘤作用的研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字） 一．课题背景：

肿瘤是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。其理想的治疗方法是能特异性的清除肿瘤而且不破坏正常的组织。目前肿瘤治疗的常规方法有三种，分别为手术治疗、化疗和放疗。常规疗法由于特异性不足，经常会对正常组织和器官造成损伤。肿瘤疫苗由于可以产生针对肿瘤的特异性反应，甚至清除肿瘤病灶，产生免疫记忆，而得到了广泛的关注和应用^[1]。其中树突状细胞疫苗是研究较多的一种疫苗。

树突状细胞是来源于骨髓的一种抗原递呈细胞，在免疫反应的调控和诱导中起着重要作用^[2]。在肿瘤疫苗的研究中，树突状细胞常作为一种佐剂来诱导肿瘤抗原特异性效应和记忆性细胞^[3]。

mGM-CSF是一种鼠源的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子，GM-CSF是在免疫领域内广泛应用的细胞因子佐剂，能刺激造血组细胞增殖成粒细胞、单核细胞和树突状细胞，活化APC并促进其捕获外来抗原以及对它进行加工处理，同时增强树突状细胞成熟和迁移^[4]。GM-CSF与外源疫苗一起或预先注入体内后，能增强DC捕获、递呈和加工抗原的能力。

人绒毛膜促性腺激素（hCG）是由妊娠期胎盘滋养层细胞分泌的一种异质二聚体糖蛋白，由alpha;亚基和beta;亚基两个亚基共同组成，主要功能为在妊娠早期至足月生产期间维持妊娠激素黄体酮，使胚胎发育^[5]。非妊娠条件下，人绒毛膜促性腺激素在人体内的含量很低。但目前发现很多肿瘤包括腺癌、黑色素瘤、前列腺癌细胞都可产生人绒毛膜促性腺激素beta;亚单位^[6]。人绒毛膜促性腺激素对胎盘和生殖细胞起源的滋养细胞肿瘤是一个非常敏感和特殊的肿瘤标志物，有些肿瘤甚至只产生beta;hCG，而这是侵袭性疾病的标志^[7]。研究表明beta;亚基能够调控恶性肿瘤的自我生长，现在人们已经在尝试用不同的beta;hCG 亚单位派生物疫苗来治疗非妊娠肿瘤^[8]。

1. 拟解决的问题

由于肿瘤的常规疗法特异性不足，且易损伤正常的组织。而单靶点的小分子类药物治疗范围窄，且易产生免疫逃逸和耐药性。因此我们利用分子克隆技术构建了融合蛋白疫苗，以期结合了mGM-CSF的融合蛋白能促使APC具有较高的装载和处理抗原能力，可提高机体对肿瘤细胞的免疫应答，达到识别和杀灭肿瘤细胞的目的。

1. 实验流程：
2. 融合蛋白的分离纯化

吸取菌液，按1:100（体积比）先接种于5mL LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡过夜培养，次日按1:100转接300mL LB液体培养基中培养，加乳糖（1:100）诱导3.5h后收集菌体，8000 r/min离心15 min，上清及沉淀均留样。用pH 8.0，50mM的Tris·HCl漂洗菌体沉淀，用菌体裂解液 (每克湿菌加入10mL)重悬菌体沉淀，反复冻融后进行超声破碎操作(工作3s，间隔3s，60%最大功率），以充分裂解菌体（每次20mL），裂解15min后取出裂解液，4℃，12000 r/min离心15 min，重组菌超声破碎后离心，取上清于冰浴中边搅拌边缓慢加入研细的硫酸铵粉末至相应饱和度（饱和度分别为15%，20%，25%，），加入速度以液体中不出现硫酸铵固体为宜。为使蛋白质充分沉淀，将达到相应饱和度的液体于4℃静置1h，12000r/min离心20min。取集中沉淀目的蛋白的硫酸铵饱和度(20%和25%)时的蛋白质沉淀，将其复溶于离子交换缓冲液（25mM Tris·HCl，pH8.0)中，为加速溶解加入1:1000（v/v)beta;-巯基乙醇。将完全复溶的蛋白溶液于4℃对离子交换缓冲液透析过夜，通过DEAE-52阴离子交换树脂对上清液做进一步分离纯化。

2.动物实验

选用6周龄的C57BL/6雄性小鼠，分为5组，分别为PBS组，mGM-CSF/beta;hCG融合蛋白组,融合蛋白致敏的DC组，环磷酰胺组和环磷酰胺加融合蛋白致敏的DC组，将小鼠随机分组，每组6只。第0天开始接瘤，并提前3天提DC培养，于第2天加入Pro刺激共培养致敏DC。接种肿瘤细胞时，在腋下部位皮下注射，每只小鼠的接种量为5times;10⁵个细胞，瘤株为黑色素瘤B16F10，接瘤后第3天开始给药，每周给药一次，连续给药三次。接瘤后，每3天测瘤体积一次，接瘤后第20天处死所有小鼠。皮下接瘤的小鼠分离肿瘤组织块并称重，比较各组抑瘤率(IR) 的差异。剥离的肿瘤放入10％甲醛溶液固定后，石蜡包埋、切片、染色，在光镜下观察肿瘤浸润侵袭以及血管生成等情况。

1. 工作进度安排

1.2015.3-2015.4 文献研读及蛋白纯化