血液病毒恒温扩增试剂盒的研究及方法评价文献综述

一、本课题的研究背景

血液病毒如HBV、HCV、HIV严重影响了人们的生活质量甚至生命安全，迅速高效的检测方法对于病毒的及时检出，确保病人的生命安全具有重要的意义。而快速简便的病毒核酸提取以及特异灵敏的核酸扩增是病毒检测的基础，所以本课题对于血液病毒提取、扩增以及检测具有临床指导意义。

二、目前常用的核酸恒温扩增方法

1) 环介导恒温扩增（loop －mediated isothermal amplification，LAMP）是针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物（包括2条内引物和2条外引物），利用一种具有链置换特性的BstDNA聚合酶，在等温条件下高效、快速、高特异地扩增靶序列，其反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。其基本原理是靶DNA 变性后， 内外引物在Bst DNA聚合酶作用下延伸，外引物的延伸产物将内引物的延伸产物置换出来，形成一个哑铃状的DNA，然后进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物。它的优点是有较高的特异性和抗干扰能力；反应体系稳定可靠；敏感性较高，扩增快速、高效；结果鉴别很简便，用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能判断扩增与否。

2) 链替代扩增（strand displacement amplification，SDA）它的基本原理是：引物与靶DNA 序列上对应的DNA单链杂交（退火），在聚合酶作用下产生带HincⅡ识别位点含5＇和3＇端的靶DNA序列，该靶序列进入SDA循环；HincⅡ限制性核酸内切酶切割识别位点，依赖DNA聚合酶在切割处延伸3＇端，并替代另一条DNA链；该替代链与引物杂交后又依次作为另一扩增反应的靶源，这些步骤在反应体系中不断重复，使靶DNA序列呈指数性增长；37℃～40℃进行23次循环后，2 h内靶序列可得到10⁸扩增。它的优点是无须温度的变化。其显著优点是灵敏性高，可快速扩增获得单链DNA分子。

3) 滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是在恒定温度下以单链环状DNA为模板，在有强链置换活性的Phi;29 DNA聚合酶的作用下，通过引物与模板环退火而进行滚环DNA合成。

4) 依赖解旋酶的恒温基因扩增（helicase－dependent isothermal DNA amplification，HDA） 是用解旋酶解开双链DNA，再依靠单链DNA结合蛋白（SSB）与模板单链结合，使模板单链处于单链状态并保护它的完整性，引物与模板杂交，然后在DNA聚合酶催化下扩增，新生成的双链DNA产物作为底物进人下一轮扩增。

5) 转录依赖的扩增系统（transcription－based amplification system，TAS）是以转录为基础的扩增技术，是一个简单、快速的体外核酸扩增方法，其反应过程分为非循环相和循环相。在非循环相，引物Ⅰ与模板RNA在逆转录酶作用下合成cDNA，形成RNA－DNA杂交体，然后RNaseH水解RNA，形成单链cDNA；引物Ⅱ与cDNA 在逆转录酶作用下合成cDNA 的第二链，形成双链DNA；双链DNA在T7 RNA聚合酶作用下转录形成反义RNA。在循环相中，引物Ⅱ与反义RNA结合，在逆转录酶作用下合成一条DNA链，形成RNA－DNA杂交体，RNaseH再次水解RNA，引物Ⅰ与单链DNA在逆转录酶作用下合成新的DNA链，T7 RNA聚合酶结合于启动因子，合成更多拷贝的反义RNA，由此不断循环。

6) 依赖核酸序列的扩增（NASBA）是在PCR 基础上发展起来的一种新的扩增方法。反应在42℃条件下，可在2 h 内将RNA模板扩增约10⁹～10¹² 倍。NASBA 需要提取病RNA， 加入AMV逆转录酶、RNaseH、T7 RNA多聚酶和2种特别设计的寡核苷酸引进行扩增。整个反应分非循环相和循环相。在非循环相中，引物Ⅰ与模板RNA退火后在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA，形成RNA－DNA杂合体，随即RNaseH 降解RNA，引物Ⅱ与cDNA退火，在反转录酶作用下合成第2条DNA互补链。双链DNA可在T7 RNA聚合酶的作用下， 经其启动子序列启动而转录RNA，RNA又可在反转录酶的作用下反转录成DNA，进入循环相，对模板进行大量扩增。

7) 转录介导的扩增（TMA）是一种利用Money鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶（既具有逆转录酶活性，又具有RNaseH活性）和T7 RNA聚合酶的共同作用，在等温条件下扩增RNA或DNA的反应系统。目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录， 逆转录酶的RNaseH活性将杂合链上的RNA降解以后，合成双链的DNA，并在T7 RNA多聚酶的作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可作为模板进行下一个循环， 整个反应是一个自催化过程。