呼吸道病毒恒温扩增试剂盒的研究及方法评价文献综述

一、课题研究背景

呼吸道病毒所引起的呼吸道感染是疾病死亡的主要原因之一。近年来，由呼吸道病毒引起的疫情暴发流行也在逐渐增多，如甲型H1N1流感病毒、腺病毒及近来暴发的H7N9流感病毒等疫情，给人类健康带来了很大的危害。这些呼吸道病毒大都具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急等特点，所引发的疾病及疫情的病原学复杂，快速精确的检测鉴定病原体不仅可以为疾病诊断治疗提供充足的依据，也可以为疫情防控提供坚实的基础。因此，寻找一种快速有效检测呼吸道病毒的方法是非常必要的。传统检验方法如病毒分离培养、免疫学检测等方法检测周期长，操作繁琐不适应推广使用，而TsugunoriNotomi等于2000年提出了环介导等温扩增(loop－mediatedisothermalamplification，LAMP)，一种新颖的核酸扩增技术，利用该技术只需在恒温条件下(60～65℃)保温几十分钟就可快速完成核酸的扩增，具有反应速度快、特异性强、敏感性高、设备简单，而且结果易于鉴定，被成功地运用于流感病毒的应急检测工作，尤其适用于基层检验检疫机构和医疗机构。为呼吸道病毒的鉴定提供实验依据，并为感染病例临床诊断、卫生监督、疫情防控等提供快速、有效的诊断手段。但市场上现存呼吸道病毒核酸提取试剂盒价格昂贵，且LAMP扩增前的处理步骤较麻烦。因此，开展关于呼吸道病毒恒温扩增试剂盒的研究及方法评价有着十分重要的意义。

二、市场上现有试剂盒/现有呼吸道病毒诊断技术

1.碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP法)

用负压吸取鼻咽深部或下方的分泌物0.5～1.0ml，采用系列呼吸道病毒单克隆抗体桥联酶标诊断试剂盒。用特异性的单克隆抗体(McAb)来测定鼻咽部分泌物脱落细胞中的未知抗原，制片后即可在普通光学显微镜下观察。它所用设备简单，操作简单又快速，特异性强、在普通的光学显微镜下容易辨认，整个操作过程只需3～4h即可完成。碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标(AP-PAAP)法，APPAAP法虽然可检测病毒抗原，但由于操作步骤过多而易出现非特异性着色，阳性结果很难判断。

2.间接免疫荧光法(IF)

取患儿的鼻咽洗液，将鼻咽洗液中脱落细胞涂片后，用丙酮固定，一抗和二抗染色后，于荧光显微镜下观察结果。IF法敏感性及特异性均较高，但因其需要昂贵的荧光显微镜，限制了它在基层医院中推广。此外其还有标本不易保存的缺点。

3.病毒分离

鼻咽分泌物经常规处理后，接种Hep-2和MDCK细胞，在含有2%牛血清的MEN培养基中生长，33℃旋转培养，连续观察细胞变化，有特征性病变出现者，确定为阳性；若盲传3代，如仍无病变出现，确定为阴性。该法特异性较强，但其费时长，一般需1、2周才能观察到变且成本较高，病毒分离阳性率低。病毒分离培养最为经典，能客观反映所感染病毒的存在及种类，但费时、费力，标本内所含的病毒数量少，会出现假阴性，不利于病毒的快速诊断。

4.多重逆转录聚合酶链反应(mRT-PCR)