RNA连接酶的表达与纯化文献综述

一、拟研究的问题：RNA连接酶可以完成2, 3-环磷酸酯和5-羟基末端的连接，在tRNA的成熟以及mRNA的剪切中发挥着重要的作用。

RNA连接酶通过依赖GTP的方式形成磷酸二酯键，作为RNA分子的有效连接工具，在分子生物学实验中发挥了重要的作用。

本课题通过阅读文献，深入了解RNA连接酶的作用和原理，完成实验设计，提高对RNA连接酶的纯度表达。

二、实验内容：1）质粒的构建及提取2）蛋白诱导、表达和纯化方法的优化3）大批量蛋白的表达纯化和浓缩4）数据整理，论文撰写三、研究手段：1提取质粒：按照质粒提取试剂盒进行提取。

2质粒转化至BL21后挑取单克隆：将冻存的BL21感受态融化后插在冰上5-10分钟，然后将5 mu;L质粒加入感受态细胞，放在冰上20分钟。

再将其放在42 ℃恒温槽热激1-2分钟，然后迅速放在冰上静置3-5分钟，之后感受态细胞加入500 mu;L LB培养基中，放入37 ℃摇床1 h。

之后用接种环在含有质粒对应抗性的平板上涂布，长出来的单菌落就是含有重组质粒的感受态细胞，将质粒进行表达。

3小量优化诱导表达条件：将菌接种至5 mL LB培养基中，37 ℃培养至OD=0.6-0.8，加入不同浓度的IPTG诱导，诱导结束后超声破碎菌体，SDS-PAGE检测蛋白诱导前后表达量，之后改变诱导时间，筛选出最佳诱导条件。

4 蛋白大量纯化及浓缩：过夜摇菌产物1:100接入1 L LB（Amp）中，培养至OD=0.6-0.8，选择最佳IPTG浓度及诱导时间，7000 rpm * 10 min离心收菌体，加入buffer A 2 mL，超声破碎30次，然后12000 rpm * 20 min离心。