一、研究内容
昆布是翅藻科植物昆布的干燥叶状体。据研究，昆布中主要成分为天然蛋白质、多糖、脂肪、纤维素、矿物质、核酸等，在这些成分中昆布多糖赋予了昆布显著而丰富的药理作用。近年来越来越多的研究致力于将昆布多糖更广泛的应用于临床以及保健品生产中。但由于多糖类物质极性大、支链多，提取过程有一定的难度。在以应用比较广的以水为溶剂的浸提法中也存在诸多影响昆布多糖提取效率的因素。本项目以单因素考察结合正交设计并配合使用响应面法的手段，研究料液比、提取温度、时间等对昆布多糖提取的影响，以建立高效、精确、环保因而值得推广的昆布多糖提取工艺。
二、文献综述
昆布最初被载于《吴普本草》，后来历代本草多有收载。在现今的药典中昆布被规定为海带科植物海带或翅藻科植物昆布（鹅掌菜）的干燥叶状体。[1]海洋藻类种类繁多，昆布属于多年生大型冷水性褐藻这类。昆布拥有的根状固着器由树枝状的又状假根组成，呈柄部圆柱状或略扁圆形，中实，其黏液腔道呈不规则的环状，散生在皮层中。叶状体扁平、革质、微皱缩、暗褐色，两侧裂片呈长舌状，叶缘一般有粗锯齿。常生于低潮线附近的岩礁上。昆布在我国的福建、浙江等沿海地区有较广的分布。一般在夏、秋二季采捞，晒干。与之类似的海带以栽培为主，呈扁平长带状。主产于辽东、山东半岛等地。[2]
在我国传统中医临床用药中，昆布是常用药之一，其药性寒、咸，具有的软坚散结，消痰，利水的丰富功效，常被用于治疗瘿瘤，瘰疬，睾丸肿痛，痰饮水肿等病症。[3]现代研究发现昆布中主要有三种多糖：褐藻胶、褐藻淀粉、褐藻糖胶。且都具有极高的临床药用价值，[4]例如：抗肿瘤作用；由于多糖所具有的免疫学机制，不但其本身具有直接抑制肿瘤生长的作用，还可以通过增强机体自身的免疫功能来抑制肿瘤细胞的扩散[5]。Hoffman等对昆布多糖的抗肿瘤机制进行了研究，得出昆布多糖对人结肠癌细胞、肺癌、肉瘤印肿瘤、宫颈癌胃癌、卵巢癌细胞、食管癌细胞等多种肿瘤均具有抑制作用[6]。抗氧化、抗衰老作用；昆布中独有的岩藻多糖提取物具有抗氧化的功能，其能有效清除机体组织尤其是脑组织中过多的氧自由基。[7]杨伟丽等的研究表明，昆布多糖能明显延缓衰老小鼠胸腺和脾脏的萎缩，提高巨噬细胞的吞噬作用能力以及小鼠血清中抗氧化酶的活性。[8]除此之外昆布多糖还具有降低体内脂质过氧化反应的作用[9]。抗凝血作用；昆布多糖在机体内外均有一定的抗凝血作用，其能够抑制血液凝固的内源和外源性途径，从而降低血液中血小板的黏附率和聚集率。[10]降血糖作用；当前社会上糖尿病患者逐步增多，临床对安全有效的降糖药物具有大量的需求。昆布多糖可以明显降低糖尿病小鼠的尿素氮水平，提高糖耐量，增加血清量和胰岛素量，对胰岛细胞具有一定的保护作用。由此可以作为一种新型的降糖药。[11]抗辖射；昆布多糖的抗辐射作用与淋巴细胞的调亡有紧密关系。有关研究表明，在给受射线照射的小鼠注射提取出的昆布多糖溶液后，实验小鼠在不同程度上恢复了细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫功能，并随着多糖浓度的增大效果愈发明显。[12]抗突变；有研究表明，昆布多糖对环憐酰胺诱发的小鼠体细胞的遗传操作具有明显的抑制作用，相关研究还指出昆布岩藻半乳聚糖硫酸酯可以抑制小鼠外周血白细胞的减少和骨髓有核细胞DNA的降低。[13]抗炎作用；昆布多糖可以抑制阿霉素肾病模型大刀的血淋巴细胞及肾组织类肝素酶的表达，对肾病大鼠有明显的抗炎操作治疗作用。[14]总之，对昆布多糖药理作用研究正在趋向于多元化发展，可预计的是在不久的将来，与昆布多糖相关的药物在人类对抗疾病的过程中会发挥着举足轻重的作用。然而伴随着多糖研究热潮的兴起，如何从昆布中有效分离提取多糖也就成为了国内外专家和学者争先研究的热点。传统昆布多糖的提取方法为水提法，水提法能通过控制物料比、提取的时间和提取的次数来增加昆布多糖的得率，其优点是避免了昆布多糖发生酸水解的可能性，从而能最大程度保存多糖分子。但此种方法也具有提取面积过大的缺点，从而增加了昆布多糖分离和纯化的难度。[15]改进后的酸提取法可以充分地避免多糖的溶出，相对提高了昆布中褐藻糖胶的含量。但由于此法中酸性物质的存在，可能会导致部分褐藻糖胶水解。因此，此种方法中应注意提取时间不能太长，一般控制1 h在为宜。酸提取法的缺点是周期过长和耗能过多。[16]随着现代分析技术的发展和进步，半仿生提取法、动态逆流提取法、超声辅助提取、酶法提取、微波辅助提取和超临界流体萃取技术等也被广泛应用于多糖的提取与分离，其中酶法辅助提取、超声辅助、微波辅助提取等被多用于植物多糖的提取。[17]例如：翁梁等对比了传统提取方法、超声辅助提取和微波辅助提取对蛹虫草多糖的提取率和抗氧化效果，结果表明：微波和超声波辅助提取显著提高了蛹虫草的提取效率，缩短了提取时间，且提取出的多糖具有良好的抗氧化性。[18]靳丹虹等比较了索氏、超声波、微波种提取方法对灵芝多糖提取效率的影响，结果表明：微波和超声都显著提高了灵芝多糖的提取率。[19]此外酶法用于植物活性多糖的提取也有报道，如黄山张元等对麦冬多糖和山药多糖的酶法提取进行了探索，结果表明：酶法辅助提取提高了多糖得率。[20]总结上述实验并尝试将这些手段运用于昆布多糖的提取，将会为昆布多糖为基础的新型药物的开发与研究奠定坚实的基础。
三、研究手段
本实验围绕探讨料液比、提取温度、提取时间这三个因素对多糖提取效率的影响以及寻找最佳多糖提取手段。首先使用单因素法确定各因素大致范围。如提取温度从20℃~90℃设计梯度，料液比以1:20~1:90为区间，提取时间从3小时到8小时每1小时或1.5小时设置一个梯度。每个单因素试验中另两个因素以参考文献给予最优值设置（温度80℃、提取时间3小时、料液比1:60）。在单因素实验中确定每个因素2~3个较优值后设计正交表，进行三因素2~3水平的正交实验。通过结果和方差分析得出最佳条件，并进一步用响应面法优化提取过程。在实验过程中也会涉及对蛋白酶、纤维素酶和果胶酶等酶法处理方法的应用以及加入超声处理步骤来探究如何改良提取过程从而提高提取效率。以上实验的多糖提取率的分析方法采用苯酚-硫酸法，过程：每次称取1 g昆布干粉溶于一定比率的蒸馏水中，然后放入恒温水浴锅中水浴一定时间（每隔半小时搅拌一次以加速多糖在水中的溶解），取出置于室温中大约20 min后搅拌均匀倒入离心管用离心机以4000 r/min离心20 min，完成后取上清液定容，接着稀释一定倍数并加入5%苯酚和浓硫酸，反应20 min后测490nm下吸光度与标准曲线以及昆布多糖标准品比较与计算来得出样品中多糖含量。
参考文献
[1]陈瑞生,陈相银,贾王俊. 昆布与海带[J]. 首都食品与医药,2015,(09):51.
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