基于配对衍生化LC-MS/MS技术的体内游离脂酰肉毒碱高灵敏定量分析方法的建立文献综述

一、 研究背景

代谢组学关注的是处于生物系统生化活动调控末端的小分子物质，其水平反映了基因表达和蛋白质的变化对系统产生的影响。一个完整的代谢组学分析流程应该包括样品的制备、数据的采集和数据的解释分析。其中，精确、灵敏、高通量的分析方法为代谢物分析提供了化学手段，是代谢组学研究的基础。到目前为止，色谱、质谱、核磁共振、红外光谱、紫外吸收光谱、荧光散射、发射性检测等分析分离手段及其组合都出现在了代谢组学的研究中，而液质联用技术由于集合了液相色谱（LC）的高分离能力与质谱（MS）的高灵敏度、高特异性，经过不断的发展革新，现已能够分析绝大部分的代谢产物，成为了代谢组学研究中最重要的分析工具。

但是，针对一些因自身化学结构而难以在色谱上保留、或因结构中缺乏可离子团而不能有效电离、或是在分析生物样品时，易受内源性物质干扰而产生很强基质效应的小分子代谢产物，往往难以采用常规的液质联用方法分析，要克服这些问题，化学衍生化是可能的出路之一。近年来化学衍生化结合液质联用的分析方法在代谢物检测方面的应用逐渐增多，两者结合往往能实现1 1gt;2的效果，通过衍生化修饰代谢产物的结构，改善物理化学性质，极大的提高了常规液质联用检测的整体性能。经文献调研，我们认为化学衍生化结合液质联用这一方法不仅能够提高样本稳定性、改善物质色谱保留行为，还通过辅助生成专属性MRM离子对，提高质谱检测的专属性和灵敏度，同时由于衍生化反应具有一定的基团靶向性，根据所生成的衍生化产物其质谱裂解规律，可以辅助代谢物的结构鉴定。

在实际应用的过程中，常根据待测物质官能团的不同来选择或合成衍生化试剂，常见的发生衍生化反应的官能团和相应衍生化试剂总结如下：

二．课题思路

肉毒碱是一种季铵类化合物，在脂肪酸氧化过程中，其在肉毒碱脂酰转移酶Ⅰ、肉毒碱脂酰转移酶Ⅱ的调控下，将脂肪酰基从细胞质转运到线粒体基质。肉毒碱也可以通过接受或释放一个酰基，在稳定细胞内辅酶A和酰基辅酶A水平中发挥作用。人体内的肉碱以游离肉碱和酰基肉碱两种形式存在，它们主要存在于心肌、骨骼肌等肌肉组织中，小部分存在于肝脏、大脑、肾脏及细胞外液(如血浆、尿液)。游离肉碱的化学结构是L-3-羟基-4-三甲基氨基丁酸，酰基肉碱为其羟基酯化的产物，包括乙酰肉碱、丙酰肉碱、丁酰肉碱、3-甲基丁酰肉碱、辛酰肉碱、豆蔻酰肉碱和棕榈酰肉碱等等。

某些酰基肉毒碱在血尿中的浓度异常可以作为数十种代谢紊乱，包括脂肪酸氧化缺陷、有机酸血症（也称为有机酸尿症）以及多种过氧化物酶体与线粒体氧化过程遗传病的诊断标志。而且，肉毒碱发挥了强大的抗氧化作用并能调节人体的免疫功能。因此，在生物样品中，游离肉毒碱与酰基肉毒碱的测定具有生物化学、生理学和临床意义。

由于各种肉毒碱的极性差异很大，从亲水游离肉毒碱，羟基和二羧酸短链酰基肉毒碱到疏水性长链和极长链酰基肉毒碱，在单一反相高效液相色谱柱上同时对亲水性和疏水性肉毒碱具有良好的保留值和峰形是具有挑战性的。而现有的GC-FID、GC-MS、LC-MS方法在检测灵敏度、操作方法的简易程度等方面也有待提高。在国外的文献报道中，HPLC-MS/MS仍是检测肉毒碱和酰基肉碱的常规方法，Junjun Ni等人使用酸性丁醇丁基化酰基肉毒碱，该法实现了肺癌患者血清中8个酰基肉毒碱的同步测定，但该法容易引起酰基肉碱的水解；Minkler使用三氟甲磺酸五氟苯甲酰甲酯进行衍生化，衍生化产物稳定性更高，通过LC/MRM-MS技术同步测定了超过60种酰基肉碱的含量；为提高一一对应内标，Jun Han等人以同位素标记的3-硝基苯肼进行衍生化，分离了包括异构体在内的24种酰基肉毒碱，并成功应用于干血斑中酰基肉碱的定量分析。

截至目前，生物样品中仍然存在大量未知数目的酰基肉碱，它们对现有分析方法的运用产生了极大的限制。本课题从脂酰肉毒碱的化学结构出发，拟借助配对衍生化策略，通过优化衍生化反应条件、色谱分离条件、质谱检测条件及生物样本前处理方式，建立高灵敏、高准确度的LC-MS/MS检测方法，旨在实现短、中、长链脂酰肉毒碱的同时定量分析，为相关疾病的机制研究、风险预测、早期诊断和治疗提供技术支撑。

三、 采用的研究手段

（一）衍生化试剂的选择与衍生化反应

本课题从脂酰肉毒碱的化学结构出发，决定使用丹磺酰哌嗪衍生化肉毒碱，以增大其在常规C18柱上的保留同时提高其质谱响应。在研究工作中，通过LC/MS检测衍生化产物，根据文献和预实验，确定反应的主要因素，通过优化衍生化反应条件、色谱分离条件、质谱检测条件，建立高灵敏、高准确度的LC-MS/MS 检测方法。反应式如下：

（二）分析方法的建立

1)分析方法的确立

参考文献方法，根据肉毒碱的理化、生物学性质及结构特征选择合适的质谱条件（母离子、子离子、碰撞能量等）和液相条件（色谱柱的选择、流动相的比例等），建立灵敏度高、特异性好的分析方法。在选定液相色谱-二级串联质谱联用法(LC-MS/MS)的测定条件后，优化样品处理方法，选择合适内标物质，同时进行色谱系统适用性研究。

2)分析方法的验证

对所建立的分析方法进行确证，应分别对方法的专属性、标准曲线与线性范围、准确度、精密度、稳定性、回收率、基质效应等进行考察，以保证分析方法的可实用性，并对所建立分析方法的优缺点进行说明。

1. 专属性：考察空白样品色谱图、空白样品外加对照物质色谱图；

2. 标准曲线与定量下限：根据标准加入法，在空白溶剂中分别加入不同浓度的待测液，进行回归分析，建立标准曲线；

3. 准确度：考察质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差；

4. 精密度：精密量取批内和批间样品各5份，按生物样本处理方法，分别配制供试品溶液，测定浓度，计算RSD；

5. 稳定性实验：分别考察标准溶液稳定性，长期冷冻稳定性，室温放置稳定性，进样器放置稳定性，反复冻融稳定性等；

6. 回收率：考察样品和内标物质的提取回收率，要求回收率在85%~115%；

7. 基质效应：考察样品基质对质谱响应的干扰。

二、参考文献

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但是，针对一些因自身化学结构而难以在色谱上保留、或因结构中缺乏可离子团而不能有效电离、或是在分析生物样品时，易受内源性物质干扰而产生很强基质效应的小分子代谢产物，往往难以采用常规的液质联用方法分析，要克服这些问题，化学衍生化是可能的出路之一。近年来化学衍生化结合液质联用的分析方法在代谢物检测方面的应用逐渐增多，两者结合往往能实现1 1gt;2的效果，通过衍生化修饰代谢产物的结构，改善物理化学性质，极大的提高了常规液质联用检测的整体性能。经文献调研，我们认为化学衍生化结合液质联用这一方法不仅能够提高样本稳定性、改善物质色谱保留行为，还通过辅助生成专属性MRM离子对，提高质谱检测的专属性和灵敏度，同时由于衍生化反应具有一定的基团靶向性，根据所生成的衍生化产物其质谱裂解规律，可以辅助代谢物的结构鉴定。

在实际应用的过程中，常根据待测物质官能团的不同来选择或合成衍生化试剂，常见的发生衍生化反应的官能团和相应衍生化试剂总结如下：