应用CRISPR/Cas9系统构建Pla2g7基因敲除的AML12混合克隆细胞系文献综述

1.文献综述

基因组编辑技术是目前进行基因功能研究所常用的重要手段之一。过去几十年来，基因组编辑技术的可行性不断提升并被广泛应用于基因相关研究。

成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats / Cas9 nuclease，CRISPR/Cas9) 技术出现于2013 年初，是一种新型的RNA 引导的核酸酶介导的靶向基因组编辑修饰技术。CRISPR是细菌免疫系统的重要组成部分，可使细菌记忆并破坏噬菌体。在基因组工程应用中，Cas9内切核酸酶通过单向导RNA（single guide RNA, sgRNA）对与sgRNA配对的特定基因座进行靶向，剪切DNA双链，从而利用生物体内非同源末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）或同源性重组（homologous recombination, HR）机制对DNA进行修复，连接断裂处的基因组DNA，使基因发生插入或缺失突变^[1]。

严重过敏反应（Anaphylaxis）是机体在接触过敏原后突发的、严重的、可危及生命的全身性过敏反应，其患病率在0.3-5.1%之间^{[2, 3]}。几乎任何外来物质都可能作为过敏原使机体发生过敏反应^[4]，常见的过敏原包括昆虫叮咬或叮咬的毒液，食物和药物，三者所致病例合计约占所有严重过敏反应病例的80%^{[5, 6]}。由药物所引起的严重过敏反应称为药源性严重过敏反应（Drug-induced anaphylaxis, DIA）。有研究表明，在住院患者中药源性严重过敏反应的发生率为0.03%，死亡率为3-9%^[7]，且由药物引起的严重过敏反应在所有致死性严重过敏反应病例中所占的比例超过50%^{[5, 6]}。

严重过敏反应的发病机制尚不完全清楚，但根据小鼠模型证实的两种严重过敏反应机制可能也适用于人类。第一种是IgE介导的严重过敏反应，该反应是白细胞介素-4（interleukin-4, IL-4）和IL-4受体依赖性且由过敏原诱导的在肥大细胞和嗜碱性粒细胞上与高亲和力FcRI受体交联引起的。其随后可释放炎症介质和细胞因子引起血管通透性增加以及平滑肌收缩，与临床表现的过敏反应症状有关。第二种机制是IgE非依赖性的，其涉及与IgG的结合，且需要比IgE依赖性途径相应地更多的抗原和抗体，IgG介导的过敏反应可能涉及巨噬细胞或嗜碱性粒细胞。这两种机制均释放血小板活化因子（platelet activating factor, PAF），但只有IgE依赖性机制释放组胺^[8]。目前IgG抗体介导的严重过敏反应仅在动物模型中存在而尚未在人体中发现^[9]，本研究所关注的药源性严重过敏反应是由IgE介导的全身性Ⅰ型超敏反应。

血小板活化因子即PAF，也被称为PAF-乙醚或乙酰基-甘油基醚-磷酸胆碱（acetyl-glyceryl-ether-phosphorylcholine, AGEPC）。PAF是一种有效的磷脂活化剂，也是介导许多白细胞功能，参与血小板聚集和脱颗粒，炎症和过敏反应的介质。一些研究确定了多种细胞类型中存在血小板活化因子受体，特别是涉及宿主防御的细胞，包括嗜碱性粒细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞等^[10]。

有少量研究对严重过敏反应的患者发生过敏后其PAF以及血小板活化因子乙酰水解酶（platelet-activating factor acetylhydrolase, PAF-AH）的浓度进行了测定，PAF-AH能使PAF快速降解。这些研究结果显示，患者发生严重过敏反应后，其体内循环PAF水平增加，而循环PAF-AH活性与过敏反应的严重程度则呈负相关^[11-13]。小鼠模型中的药理学和遗传学研究已经证实了PAF在过敏反应中的重要作用。在大多数模型中，对组胺和PAF的联合抑制几乎能够完全阻止严重过敏反应，表明组胺和PAF在严重过敏反应发生机制中可能具有相加或协同作用^[14]。PAF受PAF-AH代谢调控，PLA2G7基因编码血浆性PAF-AH，PLA2G7基因多态性可能对PAF-AH活性产生影响从而调控PAF水平。关于PLA2G7基因多态性与过敏性疾病之间的关系已有相关研究。针对PLA2G7 Val279Phe基因位点的突变情况与哮喘的研究表明，在中国哮喘患儿中，严重哮喘患儿携带Phe/Phe基因型及Phe等位基因的频率显著高于健康儿童以及患有轻、中度哮喘的儿童^[15]。另一项对日本哮喘儿童的研究也表明，哮喘儿童携带Phe/Phe基因型的频率显著高于健康儿童^[16]。

但目前尚无关于PLA2G7基因多态性与药源性严重过敏反应的相关研究，因此本研究应用应用CRISPR/Cas9系统构建Pla2g7基因敲除的AML12混合克隆细胞系，为PLA2G7基因在药源性严重过敏反应中的功能和作用机制研究提供有效工具。

2.研究目的