寡肽修饰铁蛋白纳米笼载基因编辑药物的制备及其表征文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1. 课题研究现状及进展

CRISPR/Cas9是一种高效简便的基因编辑工具，是由具有 DNA 切割活性的 Cas9 蛋白和具有 DNA 序列识别特性的导向 RNA（single guide RNA，sgRNA）组成的复合物。利用 CRISPR/Cas9 强大的基因编辑能力，人们已经实现了对细胞中 HIV 病毒整合序列的清除、诱导癌细胞的自我毁灭、神经功能障碍相关治 病基因的修复等，使 CRISPR/Cas9展现出作为基因治疗药物的巨大潜力。

作为天然合成的无机纳米粒子之一，铁蛋白纳米笼是是生命活动所必需的蛋白之一。天然铁蛋白（ferritin，Fn）主要由一个矿物质内核和一个蛋白外壳组成，通常把没有矿物质内核的铁蛋白称为去铁铁蛋白（apoferritin，AFn），又称为去铁蛋白纳米笼，它通常是由 24 个亚基自组装形成一个中空的球状蛋白质外壳，粒径为12~13 nm。通过改变溶液pH使蛋白笼亚基发生解聚与组装聚集的相互转化，能方便地装载药物；并且由于来源于机体内，其生物相容性、体内稳定性均优于大多数无机或有机材料构建的纳米载体，安全性好于病毒载体；此外，利用基因工程重组表达技术可大批生产制备重组蛋白笼，并能方便地对表面进行修饰使其具有特殊的功能；可与肿瘤细胞表面高度表达的转铁蛋白受体1（transferrin receptors，TfR1）发生特异性识别，实现主动靶向。这些优越的性能使去铁蛋白纳米笼成为了一种理想的多功能纳米药物载体，成功实现了对多柔比星（doxorubicin，Dox）等药物的递送。 如果能利用 AFn 纳米笼装载Cas9-sgRNA复合物进行体内递送，就能克服腺病毒载体（adeno-associated virus，AAV）递送带来的安全性差、脱靶效应高的问题。然而，研究表明，AFn 纳米笼在胞吞进入胞内后，会长时间停留在溶酶体中，在 pH 5.0 的溶酶体酸性环境下，蛋白笼上的孔道发生扩张释放出所装载的小分子药物，同时，过长时间停留在溶酶体中会最终导致蛋白笼本身被破坏，释放所有的内容物，这无疑会造成 Cas9-sgRNA 复合物在溶酶体中降解，不能到细胞核中发挥作用。因此，如何使 AFn 纳米笼具备溶酶体逃逸的性能是将其用于Cas9-sgRNA复合物体内递送的关键之一。

研究发现，在纳米载体表面修饰可质子化的基团而使其在特定pH环境下带正电，可实现载体的溶酶体逃逸。这提示我们，如果在AFn纳米笼的表面修饰可质子化基团如聚赖氨酸（polylysine，PLL）残基，使 AFn 纳米笼表面带有正电荷而实现溶酶体逃逸，从而保护其内部的Cas9-sgRNA复合物不被溶酶体内的酶降解破坏。

1. 拟研究的问题
2. 、去铁蛋白纳米笼装载Cas9-sgRNA复合物方法的建立与评价。

由于HFn蛋白笼在pH 3.40-10.00范围内稳定，当pH从3.40继续降低时，蛋白笼逐渐解聚成单独的24个H亚基，此时加入需装载的Cas9-sgRNA复合物与H亚基进行孵育，当 pH再次升高时，亚基又开始重聚形成笼结构，将Cas9-sgRNA 复合物包载在蛋白笼空腔内，得到nLys-HFn@Cas9-sgRNA，且该过程在pH 2.66-10.0之间是可逆的。在该载药方式中，需要考察 Cas9-sgRNA复合物与去铁蛋白的浓度比、pH值、孵育温度和时间等因素对载药量及释药行为的影响。

1. 、去铁蛋白纳米笼装载Cas9-sgRNA复合物后的制剂表征。

考虑到HFn纳米笼的胞内转运途径主要是溶酶体自噬，即在溶酶体内发生蛋白笼的解聚并释放所包载的物质，而Cas9-sgRNA复合物的本质是蛋白核酸的复合物，在溶酶体内易被降解破坏。故考虑通过基因工程对HFn 进行修饰，在FTH的N端修饰不同个数的Lys残基，得到表面修饰有不同寡聚Lys结构的去铁蛋白纳米笼（nLys-HFn）。在实验室基础上，已经筛选得到的4Lys-HFn溶酶体逃逸效果最佳，因此选用其作为载体。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE）、透射电子显微镜 （Transmission Electron Microscope, TEM）及圆二色光谱（Circular Dichroism, CD）等手段来判断是否成功载药，并对该纳米制剂的性状进行初步研究。

1. 、去铁蛋白纳米笼递送Cas9-sgRNA复合物细胞毒性的研究。

去铁蛋白纳米笼递送Cas9-sgRNA进入细胞，可能对细胞本身代谢产生影响。通过进行对照试验，采用MTT比色法检验细胞存活率，来判断该纳米制剂是否会对细胞存活产生显著影响。Cas9-sgRNA复合物应在细胞核内发挥基因编辑功能，应考察该纳米制剂是否成功入胞入核并完成溶酶体逃逸，进一步验证该载体设计的合理性与可行性。

1. 、初步评价去铁蛋白纳米笼递送Cas9-sgRNA复合物的基因编辑效率

在Cas9蛋白完成对目的基因的敲除后，采用荧光显微镜荧光密度检测，流式细胞术等方法，对基因编辑效率进行定性定量，以测定被转染细胞内的靶基因敲除效率。

1. 课题实施方案

（一）、完成对载药条件和比例的筛选。熟练掌握Native-PAGE原理及方法，筛选出寡肽修饰铁蛋白纳米笼和基因编辑药物最适载药比，在此基础上筛选出最适载药条件以为后续实验做准备。

（二）、对制剂进行表征考察。综合运用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）、圆二色光谱（CD）、Zeta电位、紫外扫谱（UV)等技术，分别对制剂的形态、粒径、结构、电位、光谱特征等进行表征。