拟研究或解决的问题：利用秀丽线虫这一模式生物对多肽进行初步的毒理学实验研究。
研究手段：1大肠杆菌OP50的培养及铺板
（1）E.coli OP50的扩大培养：取锥形瓶中原有培养液分装于无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取2～3ml新鲜的LB液体培养基加至无菌的EP管，摇晃混匀，倒入锥形瓶，用新鲜的LB液体培养基定容至50ml，37℃恒温摇床220 rpm过夜进行扩大培养。每2～3天重复一次换液操作。
（2）E. coli OP50菌苔的制备：在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取200ul菌液，加至已凝固的NGM培养皿内（为了方便线虫的传代，菌液以加至培养皿的中心为宜）。37℃恒温培养箱孵育3h左右，至菌液基本干燥形成菌苔后即可取出备用。
2秀丽线虫的培养
（1）秀丽线虫的复苏：取出在液氮中冻存的线虫，于37℃恒温水浴锅中加热并震荡，使其迅速融化。5000 rpm离心10min，弃上清，将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。
（2）秀丽线虫的传代：显微镜观察，当线虫繁殖至一定密度后，食物变得不充足，这会抑制线虫的生长，此时需要更换新的培养基。每皿用3～4ml M9缓冲液冲洗原培养基表面的线虫，转移至无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。正常情况下，每3～4天进行一次传代操作。
（3）秀丽线虫的冻存：取L1或L2期的线虫，用少量M9缓冲液清洗并离心。留200ul左右的沉淀，加入800ul已配好的线虫冻存液混匀，置于冻存管中。用封口膜封好，并登记名称、日期和实验者姓名。线虫的冻存无需预冷，可迅速置于-80℃冰箱，12h后即可转移至液氮中永久保存。
3秀丽线虫的同步化
（1）同步化条件的探索：
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编号 |
配比 |
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方案一 （1:5） |
12.50ml 1mol/L NaOH 12.50ml 5.2％ NaClO |
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方案二 （1:1） |
8.33ml 10mol/L NaOH 16.67ml 5.2％ NaClO |
|
方案三 （1:2） |
8.33ml 5mol/L NaOH 16.67ml 5.2％ NaClO |
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方案四 （1:2:水） |
1.25ml 10mol/L NaOH 5.00ml 5.2％ NaClO 18.75ml H2O |
（2）同步化条件的确定：经多次试验后确定以方案四的裂解液配比进行同步化，所得孵化率最高，效果最好。
同步化材料：培育2～3日的成虫，当多数虫体内含有大量卵时即可开始实验。
步骤一（准备）：每皿用3～4ml M9缓冲液冲洗原培养基表面的线虫，转移至无菌的10ml EP管中，2000rpm离心3min，弃大肠杆菌沉淀留上清，反复进行3次以洗净菌。再将离心机降温至4℃，调速至10000rpm离心5-6min，弃上清，留1ml沉淀，得大量成虫。
步骤二（裂解）：配制裂解液（现配现用），将新鲜的裂解液加入留有1ml线虫沉淀的EP管中，每管3ml。以每分钟20～30次的频率进行涡旋震荡，总时间控制在5～8min内为宜，至虫体几乎全部裂解。每管加入3ml M9缓冲液终止裂解。
步骤三（清洗）：调速至10000rpm于4℃离心5-7min，弃上清，留1ml沉淀，得大量虫卵。用M9缓冲液反复清洗4次后收集虫卵。
步骤四（定量）：取50ul虫卵加至96孔板中，根据卵数进行稀释，控制卵数在100只左右/孔，22℃恒温孵育24h。由于没有食物，孵育出的秀丽线虫停留在L1时期。
4 DTZX-1多肽暴露的方法
将DTZX-1多肽由储备液浓度稀释到试验所需浓度，所设剂量组为1的倍数。DTZX-1多肽浓度分别为（1nM,10nM,100nM,1000nM）。
5秀丽线虫孵化率的检测
将秀丽线虫进行同步化后，将卵液进行稀释至100个卵/50mu;L。吸取卵液置于无大肠杆菌OP50的NGM培养基上，50mu;L/孔，加入50mu;L DTZX-1多肽（1nM,10nM,100nM,1000nM），空白组加入50mu;L/孔M9缓冲液，每孔终体积是100mu;L。记录每孔实际加入卵数，每组做3个重复，于22℃恒温培养箱中孵化24h，观察每孔孵化数，计算L1幼虫的孵化率，考察DTZX-1多肽对秀丽线虫孵化率的影响。
6秀丽线虫致死率的检测
将秀丽线虫进行同步化至L1期，用M9缓冲液进行清洗和稀释，将虫液稀释至50只/50mu;L,加至提前孵育好含有大肠杆菌OP50菌苔（充足食物）的NGM培养基中，50mu;L虫液/孔。加入50mu;L/孔DTZX-1多肽（1nM,10nM,100nM,1000nM）。空白组加入50mu;L/孔M9缓冲液,每组做3个重复,每孔终体积是100mu;L。 记录每孔实际加入幼虫个数N0，于22℃恒温培养箱中培养48h。观察每孔线虫个数Nt，计算每个给药组的致死率。
7秀丽线虫身体弯曲频率的检测
将秀丽线虫进行同步化至L1期，将线虫加入提前孵育好的长有大肠杆菌OP50菌苔的NGM培养基上，每孔分别加入500mu;L DTZX-1多肽（1nM,10nM,100nM,1000nM），于22℃恒温培养箱中暴露48h。再将线虫挑至没有OP50食物的NGM培养基上，每皿10只，每组做3个重复。当线虫在空的NGM培养基上自由爬行1min后开始记录，1次弯曲定义为线虫相对于身体长轴方向上1个周期的移动，记录其在1min内的身体弯曲频数。
8秀丽线虫头部摆动频率的检测
将秀丽线虫进行同步化至L1期，将线虫加入提前孵育好的长有大肠杆菌OP50菌苔的NGM培养基上，每孔分别加入500mu;L DTZX-1多肽（1nM,10nM,100nM,1000nM），于22℃恒温培养箱中暴露48h。再将线虫挑至没有OP50食物的NGM培养基上，每皿10只，每组做3个重复，每孔加入500mu;L M9缓冲液。将1次头部摆动动作定义为观察到线虫头部从一侧摆向另一侧后再摆回初始点，记录其在1min内的头部摆动频数。
9秀丽线虫育雏数的检测
在24孔板中，每孔分别加入500mu;L DTZX-1多肽（1nM,10nM,100nM,1000nM），将成年的秀丽线虫从NGM培养基挑至24孔板中，每孔1只，每组做3个重复，于22℃恒温培养箱中暴露72h，记录所有后代数目，计算平均值。
10秀丽线虫细胞凋亡的检测
在24孔板中，每孔分别加入500mu;L DTZX-1多肽（1nM,10nM,100nM,1000nM），将秀丽线虫进行同步化至L4期，用M9缓冲液进行清洗和稀释，将虫液稀释至50只/500mu;L,加至24孔板中，500mu;L/孔，每孔2滴大肠杆菌OP50菌液作为食物。分别经过6h、24h、48h时，在96孔板中，每孔加入50mu;L含 25mu;g/mL吖啶橙染料的M9缓冲液，吸出线虫转移至对应的孔中，每孔约10只，22℃孵育2h，后将线虫吸出，用含60mu;g/mL的NaN3的M9缓冲液制作成片。荧光显微镜下观察拍照，活细胞为绿色，死细胞为橘黄色，记录生殖器中凋亡细胞数目，计算平均值。
论文课题研究进度安排：
2019年2月26日---2019年3月5日 确定选题，查阅文献。
2019年3月6日---2019年3月10日 撰写开题报告。
2019年3月11日---2019年3月25日 收集材料，分析设计实验。
2019年3月26日---2019年5月20日 进行实验，提交论文初稿。
2019年5月21日---2019年5月30日 修改论文，完善实验数据处理。
2019年6月1日---2019年6月10日 提交论文终稿，准备论文答辩。
文献综述：
DTZX-1多肽对秀丽隐杆线虫的毒性初步研究
多肽一般是指少于100个氨基酸通过肽键链接而成的化合物，其相对分子质量低于10000。多肽类药物在治疗肿瘤、糖尿病、心血管疾病、肢端体肥大症、骨质疏松症、胃肠道疾病、中枢神经系统基本、免疫疾病以及抗病毒、抗菌等方面有显著的疗效[[1]]。
多肽类药物与小分子药物相比，最大的缺点就是稳定性较差，很容易在体内进行降解，在酸、碱、高温、有机溶剂等条件下容易失活，服用方面多有不便。但是其生物活性比较高、特异性强，与受体的亲和性比较好，而且毒性低，对人体的损害程度小，具有独特的优势[[2]]。
药物的毒性评价等一般都是通过啮齿类动物体内毒性实验来完成的，但动物实验周期长，且耗资巨大[[3]]。由于过去五十年来动物使用“减少、替代、优化” 3R 原则的提出，致死性的急性毒性试验动物的福利和伦理问题目前成为质疑争议的焦点，建立发展体外细胞毒检测体系或非啮齿类模式生物模型[[4]]进行化学品的快速毒性筛检，并以此来预测啮齿类动物的急性毒性成为该领域的国际前沿研究。秀丽线虫的运动能力可反映其神经系统的基本功能, 已被广泛用于化合物神经毒性的研究, 并且常用线虫的身体弯曲频率和头部摆动频率对毒性进行评估[[5]]。目前，秀丽线虫致死率已成功用于评估药物的急性毒性和致死效应[[6]]。本研究将以秀丽线虫为模式生物，并应用包含孵化率、致死率和身体弯曲频率、头部摆动频率、育雏数、生殖细胞凋亡等指标的评价体系，对多肽进行初步的毒理学研究。
1 秀丽线虫
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，简称秀丽线虫，是一种国际公认的模式生物[[7]]，为多细胞生物，其结构简单、遗传背景清楚，生活周期短，可在实验室大量培养，与其他模式生物相比，可避免个体差异造成的误差，有利于生物毒性评价的标准化与规范化，可用于毒理学研究和毒性评价体系。
1.1秀丽线虫的优点
秀丽隐杆线虫是一种可独立生活的非寄生虫类线虫，因其生命周期短、繁殖速度快、产卵量大、身体透明、培养方便且操作简单、成本低廉等优势，已被作为一种重要模式生物广泛应用于毒理学和生物学研究中。它能够在﹣80 ℃环境中像培养细胞一样长期保存，而其他模式生物却没有这种优点。而且，从受精卵长大为成虫的时间不到 4 天，实验周期可以大大缩短[[8]]。哺乳动物基因组与秀丽隐杆线虫基因组中 30%的基因具有同源性，且已经解码了全部基因，在生命科学领域的毒理研究中已成功获得运用[[9]]。此外，线虫有 40% 的基因已被证明与人类基因具有同源性，推断以线虫为模型的毒理学研究可在很大程度上反映人类对同种毒物所产生的毒理反应[[10]]。在毒理学领域，秀丽隐杆线虫已经被应用在重金属、环境暴露评价和纳米材料等的毒性研究方面[[11]]。
1.2秀丽线虫的同步化条件探究
秀丽线虫同步化的目的在于排除不同发育时期的秀丽线虫可能对毒物做出不同的应激反应。通常，越年幼的秀丽线虫对毒物的反应越灵敏，死亡率越高．本实验将分别尝试改变裂解液配比（①将1ml 次氯酸钠溶液 0.5ml 5 M NaOH 3.5ml 双蒸水[[12]]。 ②50ul 5 M NaOH 120ul次氯酸钠盐 830ul蒸馏水[[13]]。 ③5%次氯酸钠溶液 1 mol/L NaOH 溶液以体积比 1：1 配制[[14]]）、离心转数、离心时间、离心次数、裂解时间等寻找更适宜的同步化条件。
1.3大肠杆菌OP50
在实验条件下，秀丽隐杆线虫的饲养通常以正常培养的大肠杆菌（如OP50）为食物[[15]]。线虫食物缺失会导致线虫身体偏小，并且不同的食物也会导致线虫具有不同的生长速度[[16]]。使用钴照射灭活的大肠杆菌OP50喂饲线虫，喂饲量为大肠杆菌浓缩液和液体培养基的体积比为1：50是进行线虫热耐受性及寿命试验的最适培养条件[[17]]。
2 秀丽线虫的毒性研究
2.1急性毒性
急性毒性是指生物体一次或者多次接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。致死率被广泛应用于化合物的急性毒性研究中，同时是线虫最常用的急性毒性指标，其毒性通常采用半致死剂量（median lethal dose，LD50）或半致死浓度（median lethal concentration，LC50）表示。 有研究[[18]]检测了洛克沙胂对秀丽隐杆线虫的 24 小时死亡率、半数死亡时间和寿命等相关毒性作用评价指标的影响，结果表示洛克沙胂对秀丽隐杆线虫的运动能力、生殖系统以及寿命都有不良影响。
2.2慢性毒性
慢性毒性是指受试动物连续多日接触药物所引起的毒性效应，可预测受试物可能引起的临床不良反应，了解实验动物能耐受性的最大剂量，为其它毒性试验和临床初始剂量的选择提供依据。金司仪等[[19]]分别用3种防腐剂处理秀丽线虫，观察秀丽线虫身体弯曲频率、头部摆动频率、触碰反应及体长，发现常规剂量防腐剂对秀丽线虫有一定的神经毒性。
2.3生殖毒性
生殖毒性试验(Reproductive toxicity study)是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。杨振东等[[20]]利用模式生物秀丽隐杆线虫对玉米赤霉烯酮暴露导致的生殖、发育缺陷在世代间的可传递性进行了研究。实验结果显示，ZEN暴露导致生殖毒性可产生严重缺陷，且这种缺陷在后代中没有明显的恢复。
结束语
多肽具有非常高的生物活性，其毒性极低，利用潜力也很高。目前关于多肽的毒性研究多为小鼠、大鼠等啮齿类动物，其个体差异大且无法对毒性小的药物得到大量可靠的实验数据。本实验将采用国际模式生物——秀丽线虫对多肽药进行毒理学初步试验，以期望得到大量有效数据，进而确保多肽药物临床使用的安全性和有效性。
参考文献
[1] Du Q S, Xie N Z, Huang R B. Recent development of peptide drugs and advance on theory and methodology of peptide inhibitor design [J]. Med Chem, 2015, 11 (3): 235-247.
[2] 王克全， 徐寒梅．多肽类药物的研究进展[J】．药学进展， 2015。(09)：642—650．
[3] Sprando R L，Olejnik N， Cinar HN， et a1． A method to rank order water soluble compounds according to their toxicity using Caenorhabditis elegans，a Complex Object Parametric Analyzer and Sorte，and axenic liquid media[J]．Food Chem Toxicol， 2009， 47(4)： 722—728
[4] Leung MCK, Williams PL, Benedetto A, et al. Caenorhabditis elegans: An
Emerging Model in Biomedical and Environmental Toxicology[J]. Toxicol Sci., 2008，106 (1): 5-28.
[5] Bessa C, Maciel P, Rodrigues AJ. Using C. elegans to decipher the cellular and molecular mechanisms underlying neuro developmental disorders [J]. Mol Neurobiol, 2013, 48(3):465-489.
[6] Dengg M， Van M eel J C A. 2004．Caenorhabditis elegans as model system for rapid toxicity assessment of pharmaceutical compounds [J]．Journal of Pharmacological and Toxicological Methods．5O：209—2l4
[7] 韩洪杰， 王昌禄， 陈勉华等．槲皮素对线虫抗衰老的影响及其机制的初步研究[J]．氨基酸和生物资源， 2011， 33(2)：35—38．
[8] 齐丽娟, 李国君, 马玲, 等. 秀丽隐杆线虫在生态毒理学评价中应用研究进展[J]. 毒理学杂志, 2015(01):60-65.
[9] Avery L. The genetics of feeding in Caenorhabditis elegans[J]. Genetics, 1993, 133(4): 897-917.
[10] 王大勇. 模式生物毒理学: 基于秀丽线虫研究的总结与思考[M]. 南京: 东南大学出版社, 2013: 1-3.
[11] Yang Z, Xue K S, Sun X, et al.. Multi-Toxic Endpoints of the Foodborne Mycotoxins in Nematode Caenorhabditis elegans[J]. Toxins (Basel), 2015, 7(12): 5224-5235.
[12] 操晶晶. SKN-1抗甲基汞致秀丽隐杆线虫神经毒性作用研究[D]. 华中科技大学, 2015.
[13] 张敏辉. 三唑类杀菌剂对雄性秀丽线虫生殖功能的影响及作用机制[D]. 东南大学, 2016.
[14] 高上吉. 洛克沙胂暴露胁迫对土壤线虫群落结构及秀丽隐杆线虫毒性作用的影响[D]. 华南农业大学, 2016.
[15] Brenner S. The genetics of Caenorhabditis elegans [J]. Genetic, 1974, 77 (1) : 71-94.
[16] LenaertsI，WalkerGA，Van Hoorebeke L，eta1．Dietary restriction of Caenorhabditis elegans by axenic culture reflects nutritional requirement for constituents provided by metabolicallyactivemicrobes[J]．JGerontolA BiolSci MedSci，2008，63(3)：242—252．
[17] 孔玲, 李子南, 张楠, 敬海明, 高珊, 王心宇, 陶晶, 娄云, 宁钧宇, 李国君. PM_(2.5)对线虫热耐受性的影响及线虫喂饲菌灭活方法探索[J]. 毒理学杂志, 2017, 31(03): 165-171.
[18] 高上吉. 洛克沙胂暴露胁迫对土壤线虫群落结构及秀丽隐杆线虫毒性作用的影响[D].华南农业大学,2016.
[19] 金司仪,张凡,曹艳.3种常用防腐剂对秀丽隐杆线虫毒性作用的研究[J].食品安全质量检测学报,2018,9(04):905-909.
[20] 杨振东，王加生，唐莉莉，等．玉米赤霉烯酮暴露导致的秀丽隐杆线虫生殖及发育毒性的世代间比较叨．生态毒理学报，2016，11(4)：61．68
拟研究或解决的问题：利用秀丽线虫这一模式生物对多肽进行初步的毒理学实验研究。
研究手段：1大肠杆菌OP50的培养及铺板
（1）E.coli OP50的扩大培养：取锥形瓶中原有培养液分装于无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取2～3ml新鲜的LB液体培养基加至无菌的EP管，摇晃混匀，倒入锥形瓶，用新鲜的LB液体培养基定容至50ml，37℃恒温摇床220 rpm过夜进行扩大培养。每2～3天重复一次换液操作。
（2）E. coli OP50菌苔的制备：在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取200ul菌液，加至已凝固的NGM培养皿内（为了方便线虫的传代，菌液以加至培养皿的中心为宜）。37℃恒温培养箱孵育3h左右，至菌液基本干燥形成菌苔后即可取出备用。
2秀丽线虫的培养
（1）秀丽线虫的复苏：取出在液氮中冻存的线虫，于37℃恒温水浴锅中加热并震荡，使其迅速融化。5000 rpm离心10min，弃上清，将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。
（2）秀丽线虫的传代：显微镜观察，当线虫繁殖至一定密度后，食物变得不充足，这会抑制线虫的生长，此时需要更换新的培养基。每皿用3～4ml M9缓冲液冲洗原培养基表面的线虫，转移至无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。正常情况下，每3～4天进行一次传代操作。
（3）秀丽线虫的冻存：取L1或L2期的线虫，用少量M9缓冲液清洗并离心。留200ul左右的沉淀，加入800ul已配好的线虫冻存液混匀，置于冻存管中。用封口膜封好，并登记名称、日期和实验者姓名。线虫的冻存无需预冷，可迅速置于-80℃冰箱，12h后即可转移至液氮中永久保存。
3秀丽线虫的同步化
（1）同步化条件的探索：
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