拟研究或解决的问题：初步研究镇痛多肽NDT对秀丽隐杆线虫的毒性。
采用的研究手段：本实验通过培养培养繁殖大肠杆菌和线虫，在预实验中进行探究同步化条件，通过监测秀丽线虫致死率、孵化率、弯曲频率、摆动频率、育雏数以及秀丽线虫细胞凋亡情况作为考察指标，进行综合评估,初步判定镇痛多肽NDT对秀丽隐杆线虫的毒性属于急性、慢性或生殖毒性。
1.实验方法
1.1大肠杆菌OP50的培养及铺板
1.1.1 E.coli OP50的扩大培养：取锥形瓶中原有培养液分装于无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取2～3ml新鲜的LB液体培养基加至无菌的EP管，摇晃混匀，倒入锥形瓶，用新鲜的LB液体培养基定容至50ml，37℃恒温摇床220 rpm过夜进行扩大培养。每2～3天重复一次换液操作。
1.1.2 E. coli OP50菌苔的制备：在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取200ul菌液，加至已凝固的NGM培养皿内（为了方便线虫的传代，菌液以加至培养皿的中心为宜）。37℃恒温培养箱孵育3h左右，至菌液基本干燥形成菌苔后即可取出备用。
1.2秀丽线虫的培养
1.2.1 秀丽线虫的复苏：取出在液氮中冻存的线虫，于37℃恒温水浴锅中加热并震荡，使其迅速融化。5000 rpm离心10min，弃上清，将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。
1.2.2秀丽线虫的传代：显微镜观察，当线虫繁殖至一定密度后，食物变得不充足，这会抑制线虫的生长，此时需要更换新的培养基。每皿用3～4ml M9缓冲液冲洗原培养基表面的线虫，转移至无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。正常情况下，每3～4天进行一次传代操作。
1.2.3秀丽线虫的冻存：取L1或L2期的线虫，用少量M9缓冲液清洗并离心。留200ul左右的沉淀，加入800ul已配好的线虫冻存液混匀，置于冻存管中。用封口膜封好，并登记名称、日期和实验者姓名。线虫的冻存无需预冷，可迅速置于-80℃冰箱，12h后即可转移至液氮中永久保存。
1.3秀丽线虫的同步化
1.3.1 同步化条件的探索：
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编号 |
配比 |
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方案一 （1:5） |
12.50ml 1mol/L NaOH 12.50ml 5.2％ NaClO |
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方案二 （1:1） |
8.33ml 10mol/L NaOH 16.67ml 5.2％ NaClO |
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方案三 （1:2） |
8.33ml 5mol/L NaOH 16.67ml 5.2％ NaClO |
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方案四 （1:2:水） |
1.25ml 10mol/L NaOH 5.00ml 5.2％ NaClO 18.75ml H2O |
1.3.2 同步化条件的确定：经多次试验后确定以方案四的裂解液配比进行同步化，所得孵化率最高，效果最好。
同步化材料：培育2～3日的成虫，当多数虫体内含有大量卵时即可开始实验。
步骤一（准备）：每皿用3～4ml M9缓冲液冲洗原培养基表面的线虫，转移至无菌的10ml EP管中，2000rpm离心3min，弃大肠杆菌沉淀留上清，反复进行3次以洗净菌。再将离心机降温至4℃，调速至10000rpm离心5-6min，弃上清，留1ml沉淀，得大量成虫。
步骤二（裂解）：配制裂解液（现配现用），将新鲜的裂解液加入留有1ml线虫沉淀的EP管中，每管3ml。以每分钟20～30次的频率进行涡旋震荡，总时间控制在5～8min内为宜，至虫体几乎全部裂解。每管加入3ml M9缓冲液终止裂解。
步骤三（清洗）：调速至10000rpm于4℃离心5-7min，弃上清，留1ml沉淀，得大量虫卵。用M9缓冲液反复清洗4次后收集虫卵。
步骤四（定量）：取50ul虫卵加至96孔板中，根据卵数进行稀释，控制卵数在100只左右/孔，22℃恒温孵育24h。由于没有食物，孵育出的秀丽线虫停留在L1时期。
1.3.3 镇痛肽T1暴露的方法
将镇痛肽T1由储备液浓度稀释到试验所需浓度，所设剂量组为1的倍数。镇痛肽T1浓度分别为（1nM,10nM,100nM,1000nM）。
2.秀丽线虫各项指标检测
2.1秀丽线虫孵化率的检测
将秀丽线虫进行同步化后，将卵液进行稀释至100个卵/50mu;L。吸取卵液置于无大肠杆菌OP50的NGM培养基上，50mu;L/孔，加入50mu;L镇痛肽T1（1nM,10nM,100nM,1000nM），空白组加入50mu;L/孔M9缓冲液，每孔终体积是100mu;L。记录每孔实际加入卵数，每组做3个重复，于22℃恒温培养箱中孵化24h，观察每孔孵化数，计算L1幼虫的孵化率，考察镇痛肽T1对秀丽线虫孵化率的影响。
2.2秀丽线虫致死率的检测
将秀丽线虫进行同步化至L1期，用M9缓冲液进行清洗和稀释，将虫液稀释至50只/50mu;L,加至提前孵育好含有大肠杆菌OP50菌苔（充足食物）的NGM培养基中，50mu;L虫液/孔。加入50mu;L/孔镇痛肽T1（1nM,10nM,100nM,1000nM）。空白组加入50mu;L/孔M9缓冲液,每组做3个重复,每孔终体积是100mu;L。 记录每孔实际加入幼虫个数N0，于22℃恒温培养箱中培养48h。观察每孔线虫个数Nt，计算每个给药组的致死率。
2.3秀丽线虫身体弯曲频率的检测
将秀丽线虫进行同步化至L1期，将线虫加入提前孵育好的长有大肠杆菌OP50菌苔的NGM培养基上，每孔分别加入500mu;L镇痛肽T（1nM,10nM,100nM,1000nM），于22℃恒温培养箱中暴露48h。再将线虫挑至没有OP50食物的NGM培养基上，每皿10只，每组做3个重复。当线虫在空的NGM培养基上自由爬行1min后开始记录，1次弯曲定义为线虫相对于身体长轴方向上1个周期的移动，记录其在1min内的身体弯曲频数。
2.4秀丽线虫头部摆动频率的检测
将秀丽线虫进行同步化至L1期，将线虫加入提前孵育好的长有大肠杆菌OP50菌苔的NGM培养基上，每孔分别加入500mu;L镇痛肽T（1nM,10nM,100nM,1000nM），于22℃恒温培养箱中暴露48h。再将线虫挑至没有OP50食物的NGM培养基上，每皿10只，每组做3个重复，每孔加入500mu;L M9缓冲液。将1次头部摆动动作定义为观察到线虫头部从一侧摆向另一侧后再摆回初始点，记录其在1min内的头部摆动频数。
2.5秀丽线虫育雏数的检测
在24孔板中，每孔分别加入500mu;L镇痛肽T1（1nM,10nM,100nM,1000nM），将成年的秀丽线虫从NGM培养基挑至24孔板中，每孔1只，每组做3个重复，于22℃恒温培养箱中暴露72h，记录所有后代数目，计算平均值。
2.6秀丽线虫细胞凋亡的检测
在24孔板中，每孔分别加入500mu;L镇痛肽T1（1nM,10nM,100nM,1000nM），将秀丽线虫进行同步化至L4期，用M9缓冲液进行清洗和稀释，将虫液稀释至50只/500mu;L,加至24孔板中，500mu;L/孔，每孔2滴大肠杆菌OP50菌液作为食物。分别经过6h、24h、48h时，在96孔板中，每孔加入50mu;L含 25mu;g/mL吖啶橙染料的M9缓冲液，吸出线虫转移至对应的孔中，每孔约10只，22℃孵育2h，后将线虫吸出，用含60mu;g/mL的NaN3的M9缓冲液制作成片。荧光显微镜下观察拍照，活细胞为绿色，死细胞为橘黄色，记录生殖器中凋亡细胞数目，计算平均值。
3.文献综述
镇痛多肽NDT对秀丽线虫的毒性初步研究
3.1关于镇痛多肽的研究[4]。
关于镇痛多肽类分子作用机制的研究。疼痛是机体的正常保护性机制，也是临床疾病常见症状。笔者查阅相关资料发现，关于镇痛多肽类分子的研究，多集中于从离子通道类、阿片受体类、激酶类和其他类等方面探究镇痛多肽的作用机制来源、氨基酸序列、活性位点和作用机制等[4]。
研究发现，离子通道类镇痛多肽，多源于天然动植物体内提取。临床证实具有良好的镇痛活性，来源广泛、毒副作用小、半衰期长、药效明显。蝎毒作为传统中药，定惊止痛效果良好。当前在蝎毒里已发现50 多种钠离子通道毒素，20 多种钾离子通道毒素，还有少部分氯离子通道毒素类似物[5]。从捕鸟蛛毒素粗提物中分离纯化得到一种可作用于N-型钙离子通道的神经毒素阻断剂，该肽分子有明显镇痛作用[7]。从蛇毒中分离出的黑曼巴毒肽，通过抑制表达中枢和外周的酸敏性离子通道而发挥镇痛作用。实验证实，与吗啡效果相同，但不会产生快速的耐药性和依赖性，因此副作用要小得多。
常见的阿片类镇痛药物如吗啡，成瘾性及副作用较强，用药需谨慎。天然阿片类毒素，活性强，成瘾性低，耐药性低。如南美珊瑚蛇毒素、响尾蛇毒素等。激酶的磷酸化反应在镇痛过程中的作用也非常关键。例如，蛋白激酶磷酸化离子通道，减少痛觉敏化[16]。
目前镇痛多肽的研究仍存在问题，如多肽蛋白在兴奋组织和初级传入纤维中的表达分布以及潜在的副作用等[14]。
3.2关于秀丽隐杆线虫的研究[2]。
秀丽隐杆线虫作为一种重要的模式生物被广泛地用于神经生物学、衰老及发育和药物筛选等研究中[8]。
秀丽隐杆线虫在肠道菌群研究中的应用。如刘倩、范誉川等人在《生命科学》中提及，肠道菌群作为人体的重要组成部分,在物质代谢、免疫应答等方面起着重要作用，目前对其组成和功能研究已成为热点[1]。因其结构简单、生活周期短、便于制备无菌个体等特性，在肠道菌群与机体共生关系及功能研究方面受到广泛应用[19]。由于其肠道功能与高等动物功能相似、遗传背景清晰、结构简单、生活周期短，因此在随着高通量测序、代谢组学、蛋白质组学等新技术发展，在研究宿主关系、机理探索等方面有着更为广泛的应用。
秀丽隐杆线虫病原逃避行为调控的分子机制研究。如邹伟、王琦等人在《云南大学学报》中这样表述，它生活在复杂生态系统中，具备对环境刺激变化的敏锐感知。根据逃避行为的方式和作用机制不同可将其分本能逃避行为和学习型逃避行为[9]。动物肠道对病原细菌十分易感，铜绿假单胞菌和沙门氏菌能在线虫肠道繁殖，并在数天内将其杀死，线虫通过启动天然免疫和逃避行为进行自我保护。[6]其中胰岛素信号途径同时参与了天然免疫和病原逃避行为的调控。
秀丽隐杆线虫固有免疫功能神经调控机制研究进展。秀丽隐杆线虫作为研究宿主与病原菌之间相互作用的经典模式动物，近年来在神经和免疫之间相互作用的分子与遗传机制等方面的研究取得了长足进展。[3]研究表明，线虫神经元通过释放神经递质与神经多肽(如多巴胺、NLP-20)等，激活相关信号通路途经,参与线虫对病原菌的识别、逃避、调节物理屏障防御能力和激活固有免疫反应，并表达分泌抗菌肽以清除病原菌等的调控进程[11]。
3.3关于大肠杆菌及其毒性的研究[20]。
关于大肠杆菌克隆、表达与纯化的研究。大肠杆菌是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌，周身鞭毛，能运动，无芽孢，是原核生物具有由肽聚糖组成的细胞，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核但有拟核，细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体[12]。《中国药科大学学报》中，王学军、顾凯等在《重组人源胰岛素原C肽在大肠杆菌中的克隆、表达与纯化》中表示，大肠杆菌能生产胰岛素。将人的胰岛素基因送到大肠杆菌里，胰岛素基因和大肠杆菌遗传物质相结合，人的胰岛素基因在大肠杆菌的细胞生产出胰岛素，并随着繁殖胰岛素基因[13]，后代也能生产胰岛素，本研究用于治疗糖尿病。
关于大肠杆菌与宿主关系的研究。美国科罗拉多大学波德分校的Bin Qi和Min Han发表的研究论文“Microbial Siderophore Enterobactin Promotes Mitochondrial Iron Uptake and Development of the Host via Interaction with ATP Synthase”。当给线虫喂经基因改造后，不产生肠杆菌素的大肠杆菌时，它们生长缓慢且铁水平较低。当将肠杆菌素重新导入线虫时，它们恢复自然生长，而且体内铁水平上升[20]。证实作为一种导致食物中毒，或从宿主身上偷走营养物的病原体的大肠杆菌，通过产生帮助细胞摄取铁的化合物，在促进宿主健康中，发挥关键作用[10]。这项研究可能最终开发出有效地治疗缺铁性贫血的方法。
4.结束语
越来越多的研究表明，肠道菌群与宿主的衰老和寿命紧密相关，通过饮食、服用补充剂等方式调节肠道菌群组成能够改善老年人的健康。[2]目前，关于肠道菌群与宿主之间关系的研究多局限于微生物组成、分类及宏基因组分析，而对于其细胞和分子机制方面的研究较少，这在一定程度上是由于哺乳动物饮食、生活方式的多样性，肠道菌群的复杂性，以及现有技术的局限性等[15]。秀丽隐杆线虫模型在快速识别与宿主衰老和寿命相关基因及分子机制研究方面表现出良好的有效性和便利性。当然，以秀丽隐杆线虫为模式生物，研究人类肠道菌群，还存在很多局限性，例如，在线虫肠道中，定殖微生物数量过少、线虫与人类种属差异太大等[17-18]。因此，在具体研究中，要结合实验内容和目的，判断是否可以选择秀丽隐杆线虫为模式生物，必要时需选择其他高等模式生物进行进一步验证，从而使研究结果更为合理准确。
参考文献
[1]刘倩,范誉川,刘重慧,魏涛.模式生物秀丽隐杆线虫在肠道菌群研究中的应用[J/OL].生命科学,2019(01):1-6[2019-03-07].https://doi.org/10.13376/j.cbls/2019011.
[2]王慧,赵江,杨胜楠,张晓寒,程静,王浩.D-手性肌醇对高糖导致氧化损伤线虫延缓衰老的作用及机制[J].食品工业科技,2019,40(02):282-286.
[3]杰里米·伯格,思羽.单细胞尺度的生命探索[J].世界科学,2019(01):1.
[4]吴鹏翔,谢健豪,郭雅茹,于瑞河,戚微岩,徐寒梅.镇痛多肽类分子研究进展[J].药学进展,2017,41(12):934-942.
[5]刘息芳. 重组蝎毒活性多肽AGAP的镇痛作用及钠离子通道机制[A]. 中国药理学会.中国药理学会第十一次全国学术会议专刊[C].中国药理学会:中国药理学会,2011:1.
[6]张维军,赵世坤,于洋,何希文,奚晶,栾洋,李遥,陈翔.用于线虫药物筛选的微流控梯度芯片和自动化平台[J].微纳电子技术,2019,56(01):78-84.
[7]陈珺君,刘芳,廖先清,张志刚,闵勇,饶犇,杨自文,周荣华,刘晓艳.两种蜘蛛毒素肽与苏云金芽胞杆菌Cry1Ac蛋白的融合表达及杀虫活性[J].中国生物防治学报,2018,34(06):838-847.
[8]吴超,王慧,张晓伟,秦海兰,周兴华,赵延胜.L-阿拉伯糖促进秀丽隐杆线虫的生长发育及降低脂肪合成[J].现代食品科技,2018,34(12):7-11.
[9]邹伟,王琦,林容,黄晓玮.秀丽隐杆线虫病原逃避行为调控的分子机制研究进展[J].云南大学学报(自然科学版),2018,40(06):1277-1282.
[10]吴超. L-阿拉伯糖对秀丽隐杆线虫生长指标的影响作用研究[A]. 中国食品科学技术学会（Chinese Institute of Food Science and Technology）.中国食品科学技术学会第十五届年会论文摘要集[C].中国食品科学技术学会（Chinese Institute of Food Science and Technology）:中国食品科学技术学会,2018:2.
[11]贺莉雅,黄晓雯,刘应辉,陈志文,席丽艳.马尔尼菲篮状菌感染动物模型的研究进展[J].菌物学报,2018,37(10):1324-1329.
[12]杜方舟,李春义.线虫在药物开发中的进展及在鉴别鹿茸活性成分上的应用[J].基因组学与应用生物学:1-10.
[13]周玲,王平,蔡铭,许湘.补肾化痰复方对秀丽线虫神经保护的影响[J].时珍国医国药,2018,29(10):2348-2351.
[14]冯程. 不同粒径微塑料对秀丽隐杆线虫的毒性影响及其作用机制[A]. 中国毒理学会.中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛论文摘要[C].中国毒理学会:中国毒理学会,2018:1.
[15]张颖. 十氯酮对秀丽隐杆线虫精子形成的影响[A]. 中国毒理学会.中国毒理学会第七次全国会员代表大会暨中国毒理学会第六次中青年学者科技论坛论文摘要[C].中国毒理学会:中国毒理学会,2018:1.
[16]逯城宇,尹秀菊,安金双,赵凌志,滕利荣.林蛙皮多肽水提物的提取及镇痛活性的初步研究[J].时珍国医国药,2012,23(06):1559-1560.
[17]何雪珠,李洪博,胡亚茹,刘馥雯,林森,陆强,林匡飞.2种新烟碱类杀虫剂对秀丽隐杆线虫神经毒性研究[J].生态毒理学报,2018,13(05):235-241.
[18]屠泽慧,聂文,郭肖颖,蔡克周.低剂量丙烯酰胺多世代持续暴露对秀丽隐杆线虫的损伤作用[J].生态毒理学报,2018,13(05):200-207.
[19]张秀妹,高洁,陈春红,涂海军.秀丽隐杆线虫固有免疫功能神经调控机制研究进展[J].遗传,2018,40(12):1066-1074.
[20]Bin Qi, Min Han. Microbial Siderophore Enterobactin Promotes Mitochondrial Iron Uptake and Development of the Host via Interaction with ATP Synthase. Cell, Published Online: 23 August 2018, doi:10.1016/j.cell.2018.07.032.
拟研究或解决的问题：初步研究镇痛多肽NDT对秀丽隐杆线虫的毒性。
采用的研究手段：本实验通过培养培养繁殖大肠杆菌和线虫，在预实验中进行探究同步化条件，通过监测秀丽线虫致死率、孵化率、弯曲频率、摆动频率、育雏数以及秀丽线虫细胞凋亡情况作为考察指标，进行综合评估,初步判定镇痛多肽NDT对秀丽隐杆线虫的毒性属于急性、慢性或生殖毒性。
1.实验方法
1.1大肠杆菌OP50的培养及铺板
1.1.1 E.coli OP50的扩大培养：取锥形瓶中原有培养液分装于无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取2～3ml新鲜的LB液体培养基加至无菌的EP管，摇晃混匀，倒入锥形瓶，用新鲜的LB液体培养基定容至50ml，37℃恒温摇床220 rpm过夜进行扩大培养。每2～3天重复一次换液操作。
1.1.2 E. coli OP50菌苔的制备：在经过紫外灭菌10min后的超净台中，用无菌枪头吸取200ul菌液，加至已凝固的NGM培养皿内（为了方便线虫的传代，菌液以加至培养皿的中心为宜）。37℃恒温培养箱孵育3h左右，至菌液基本干燥形成菌苔后即可取出备用。
1.2秀丽线虫的培养
1.2.1 秀丽线虫的复苏：取出在液氮中冻存的线虫，于37℃恒温水浴锅中加热并震荡，使其迅速融化。5000 rpm离心10min，弃上清，将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。
1.2.2秀丽线虫的传代：显微镜观察，当线虫繁殖至一定密度后，食物变得不充足，这会抑制线虫的生长，此时需要更换新的培养基。每皿用3～4ml M9缓冲液冲洗原培养基表面的线虫，转移至无菌的10ml EP管中，5000 rpm离心10min，弃上清。将线虫加入提前孵育好的长有E.coli OP50菌苔的NGM培养基上，于22℃恒温培养。正常情况下，每3～4天进行一次传代操作。
1.2.3秀丽线虫的冻存：取L1或L2期的线虫，用少量M9缓冲液清洗并离心。留200ul左右的沉淀，加入800ul已配好的线虫冻存液混匀，置于冻存管中。用封口膜封好，并登记名称、日期和实验者姓名。线虫的冻存无需预冷，可迅速置于-80℃冰箱，12h后即可转移至液氮中永久保存。
1.3秀丽线虫的同步化
1.3.1 同步化条件的探索：
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