中药麦冬有效成分RUS对中药麦冬有效成分RUS对血栓形成及缺氧诱导因子的作用文献综述

1. 研究目的

静脉血栓栓塞症（VTE）是一种慢性血管性疾病，主要表现为深静脉血栓（DVT）及肺栓塞（PE），其中深静脉血栓多发生在下肢深部大静脉，故又称下肢静脉血栓。静脉血栓栓塞症致死致残率极高，是继脑中风、心肌梗死之后的世界第三大致死性心血管疾病。因此，寻找有效的防治 DVT 的靶点和药物是医学研究的热点和难点。鲁斯可皂苷元（Ruscogenin， RUS)，是中药麦冬中的主要皂苷元和有效成分之一，具有抗炎抗血栓活性。本课题拟在前期研究基础上，考察RUS对静脉血栓治疗作用，并探讨在血栓形成过程中缺氧诱导因子的作用，为将鲁斯可皂苷开发成深静脉血栓的候选药物提供临床前的基础研究依据。

1. 拟研究或解决的问题

鲁斯可皂苷对小鼠深静脉血栓形成的影响及通过缺氧途径对缺氧诱导因子的调节作用。

1. 主要研究手段及内容
2. 下腔静脉结扎法致小鼠深静脉血栓模型制备（IVCL）

C57BL/6J 小鼠用 4%的水合氯醛按体重（10 mL/kg）进行腹腔麻醉，麻醉满意后，动物取仰卧位，四肢固定于操作台上，腹中部皮肤去毛，75%乙醇消毒 2 遍。于腹正中线切开皮肤约 1.5 cm，沿腹正中线剪开进腹，将腹腔内肠管移出体外，用生理盐水湿纱布包裹后置于腹部右侧。打开腹膜后，仔细游离左肾静脉与下腔静脉汇合处，用 6-0 外科非吸收性丝线于左肾静脉下方结扎下腔静脉，4-0 外科非吸收性一次性连续缝合腹壁和皮肤，手术完毕后将动物置于放有清洁垫料的饲养盒中，动物保暖、自由饮水、进食。术后不用抗生素。假手术组腹腔麻醉开腹后下腔静脉串线不结扎即关腹。

1. 苏木素-伊红（H-E）染色检测病理变化

取组织石蜡切片，于室温平衡 30 min。用 PBS 洗涤 3 次，除去 OCT。苏木素染色液染色 5-10 min。用 PBS 冲洗去除多余的染色液，10 min。95%乙醇 5 sec。伊红染色液染色 30 sec-2 min。70%乙醇洗涤 2 次，吸干。显微镜下观察并拍摄照片，细胞核呈蓝色，而细胞浆呈粉红色。

1. 免疫荧光染色测定蛋白表达情况

取出冻存于-70 ℃ 的组织切片，于室温平衡 30 min。浸于 PBS 中 5min 除去 OCT。吸干玻璃片上液滴，组画笔圈定样本，在圈内滴加封闭液，室温下封闭 1 h。吸干封闭液后，用 PBS 润洗 3 次，每次 5min。加入稀释好的一抗，4℃ 孵育过夜。吸干一抗，用 PBS 润洗 3 次，每次 5 min，加入稀释过的荧光标记的二抗，室温孵育 2 h。PBS 洗 3 次，每次 5 min，吸干液体，加入 DAPI，室温放置 5 min。PBS 洗 3 次，每次 5 min，吸干，加入抗荧光淬灭剂封片。于荧光显微镜下拍摄照片。

1. 小鼠下腔静脉血管内皮蛋白的提取与检测

取小鼠下腔静脉血管，去除内容物，液氮冷冻并研碎，加入适量裂解液(lysis buffer)，匀浆 2 min，冰浴 30 min，然后 12000 rpm，4 °C 离心 10 min，将上清转移至新道夫管中，即为提取得到的总蛋白溶液，利用 BCA 试剂盒定量蛋白，并加入 loading buffer 得到 Western blotting 样品，上样量为30 g，使用Western blotting 检测蛋白表达。

在动物模型基础上，给予鲁斯可皂苷，考察对血栓重量、血栓长度、病理变化等指标的影响，并采用免疫荧光技术、蛋白印记技术测定下腔静脉血管内皮中缺氧诱导因子-1alpha;（HIF-1alpha;）表达情况，酶联免疫吸附测定血管内皮生长因子（VEGF）的表达，确证RUS对深静脉血栓的改善作用，并探讨其可能通过缺氧途径发挥作用的主要机制。

1. 成果形式

成果将以基础研究论文的形式呈现。

1. 课题进度

第一阶段（实习开始至三月末）：查阅相关文献，学习深静脉血栓动物模型制备；

第二阶段（三月末至四月末）：完成主要体内实验的指标测定；