荧光素酶标记的Reg3a过表达LoVo细胞系的构建、筛选及检验文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

⼀、⽂献综述
世界卫⽣组织下属国际癌症研究机构（IARC）发布的全球癌症统计数据《全球癌症报告》中提到，2018年全球新增1810万例癌症病例（男性950万，⼥性860万），死亡⼈数达960万（男性540万，⼥性420万）^【1】，全球癌症负担进⼀步加重，⽽中国作为⼈⼜⼤国更是占据了癌症发病与死亡的⼀⼤部分。在这之中结直肠癌是⼈类主要恶性肿瘤之⼀，每年全球约有120 万名结直肠癌患者，⽽有超过 60 万名患者直接或间接死于结直肠癌，其发病率和死亡率分别位于第三位和第四位^【2】。其中肝脏是结直肠癌⾎⾏转移最主要的靶器官，结直肠癌肝转移(colorectal cancer liver metastases)是结直肠癌治疗的重点和难点之⼀。15%~25%的结直肠癌病⼈在确诊时即合并肝转移，另有 15%~25%的病⼈将在结直肠癌根治术后发⽣肝转移，其中绝⼤多数(80%~90%)的肝转移灶初始⽆法获得根治性切除。结直肠癌肝转移也是结直肠癌病⼈最主要的死亡原因，未经治疗的结直肠癌肝转移病⼈中位⽣存期仅 6.9 个⽉，肝转移灶⽆法切除病⼈的 5 年存活率lt;5^【3】
Reg 基因家族(regenerating family，Reg)在1987年TErazono等⼈^【4】在研究胰腺炎和胰岛增殖过程中被发现，其编码的蛋⽩质相对分⼦质量为16 000左右。Reg蛋⽩能够通过旁分泌或⾃分泌途径调控细胞的增殖和分化。Reg 蛋⽩在体内外具有促进细胞增殖、抗凋亡及刺激组织再⽣等功能，并与多种疾病的发⽣与发展密切相关。Reg 家族蛋⽩有多种成员，其⼀级结构均由⼀条N段均有⼀段信号肽的多肽链构成。C 段具有⼀个⾼度保守的钙依赖型凝集素样结构域(C-type lectin domain，C-type lectin 结构域) ^【5】。C-type lectin 结构域由 110 ~ 130 个氨基酸组成，存在 1 个或多个碳⽔化合物结合位点，是凝集素结构域(lectin domain)的⼀种^【6】。 Reg和Reg相关基因构成了⼀个多基因家族（Reg家族），其中多个成员是在⼈和⿏⾝上发现的，根据它们的同源性可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型。Ⅰ型包括⼈的 Reg1alpha;、Reg1beta;以及⼩⿏的Reg1。Ⅱ型主要为Reg2。Ⅲ型包括⼈的HIP/PAP， ⼤⿏的Reg3/PAP2、PAP3， ⼩⿏的Reg3alpha;、Reg3beta;以及Reg2。Ⅳ型包括⼈的Reg4。它们的氨基酸序列具有⼀定的同源性^【7】。Reg蛋⽩家族成员的氨基酸序列存在着⼀定的差异，随着蛋⽩氨基酸残基的变化有可能会导致⽣物学功能的变化。
正常情况下，Reg3家族蛋⽩在⼩⿏和⼈的胃肠道组织中⾼表达^【8】,Reg3基因有Reg3a、Reg3beta;和Reg3g三个亚基^【9】，⼈Reg3a与⿏Reg3的同源性最⾼，两者均有调控细胞凋亡，细胞增殖，免疫应激等能⼒。Reg3a已被证明其参与多种癌症的发展，例如肝癌、结直肠癌和胃癌。在肝肿瘤发⽣过程中,Reg3a是Wnt信号通路的靶点，与beta;-catenin的突变有关^【10】，在部分原发性⼈类结直肠癌中发现与正常结肠组织相⽐，Reg3a的表达显著降低，进⼀步的临床特征分析表明，REG3A表达⽔平越⾼，肿瘤体积越⼤，分化越差，肿瘤分期越⾼，⽣存率越低，Reg3a可能通过激活AKT和ERK通路调控细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭，从⽽成为致癌基因^【11】，Reg3a过表达可能抑制结直肠癌细胞的侵袭和增殖，促进结直肠癌细胞凋亡。⽽Reg3a的下调促进了结直肠癌细胞的侵袭，抑制了结直肠癌细胞的增殖凋亡^【12】，但其具体机制尚不清楚。荧光素酶( luciferase) 报告基因作为⼀种常⽤的报告基因系统， 在细胞中的背景⾮常低， ⽣物荧光穿透⼒强， 可⽤以标记肿瘤细胞^【13】。⽽活体成像技术是⼀种⾼灵敏度⽽直观的影像技术，能够准确地观察经荧光素酶标记的细胞体内定位、增殖及转移情况^【14】。 研究显⽰，荧光素酶标记的肿瘤细胞在⼩⿏体内成瘤后，利⽤灵敏的活体成像系统，检测荧光素的发光强度，可间接反映出⼩⿏体内肿瘤细胞的数量、⼤⼩和转移情况^【15】，因此活体成像技术是筛选抗肿瘤药物和评价抗肿瘤药物有效性的新兴⼿段^【16】 。为了研究Reg3a在结直肠癌转移中的作⽤，我们决定构建荧光素酶标记的Reg3a过表达LoVo细胞系。

参考⽂献
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⼆、拟解决的问题
荧光素酶标记的Reg3a过表达LoVo细胞系的构建、筛选及检验。
三、采⽤的研究⼿段
1. 荧光素酶标记的Reg3a过表达LoVo细胞的构建及筛选
1.1 Reg3a过表达慢病毒质粒的获得
从NCBI⽹站获得⼈源Reg3a蛋⽩的mRNA序列，以此为基础获得Reg3a蛋⽩的cDNA序列,送到基因公司合成带有相应酶切位点及kozak序列的序列，将此序列直接插⼊到过表达质粒中，返回带有荧光素酶报告基因、过表达cmv启动⼦、嘌呤霉素筛选基因、 Reg3a序列的慢病毒质粒及其对照质粒，并进⾏测序验证插⼊序列的准确性。
1.2 Reg3a过表达慢病毒质粒的验证
将从公司获得的Reg3a过表达慢病毒质粒以及对照质粒通过瞬时转染到不会产⽣Reg3a的293T细胞，通过WB检验Reg3a的表达。
1.3 慢病毒的包装
提取并纯化慢病毒过表达质粒、对照质粒、慢病毒包装质粒，培养293T细胞，将过表达质粒和包装粒以及对照质粒和包装质粒按⽐例混合，与Lipo2000进⾏混合，加⼊到293T细胞中， 48h收上清， 72h收上清，将收的病毒进⾏浓缩。
1.4 慢病毒转染⽬的细胞
培养LoVo细胞，状态良好时，加⼊病毒进⾏转染，转染24h后换成新鲜的培养基。 2-3天后进⾏嘌呤霉素的筛选。将筛选得到的细胞培养，冻存。
2.荧光素酶标记的Reg3a过表达LoVo细胞的验证
2.1 WB验证Reg3a过表达
将转⼊过表达质粒的LoVo细胞以及转⼊对照质粒的LoVo细胞⽤RIPA裂解液裂解，收上清，做WB印迹实验，以beta;-actin 作为基准，⽐较Reg3a的表达量是否显著上升
2.2荧光素酶的验证
利⽤荧光素酶报告基因试剂盒检测荧光素酶的表达