Sall2锌指结构对诱导p16表达的分子机制文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1. 目的

Sall2，也被叫做P150和hsal2，是一种的肿瘤抑制因子和多瘤抗原失活靶点，能够上调p16的转录和翻译，从而抑制肿瘤生长。本课题旨在探究Sall2锌指结构对p16表达上调作用的具体分子机制。

1. 研究内容

Sall2，也被叫做P150和hsal2，是一种公认的肿瘤抑制因子。Sall2能够结合DNA序列GGG(T/G)GGG，所以它属于一种GC盒的结合蛋白，是转录因子Sp1家族成员。P16，也被叫做MTS1和P16INK4A，是一种细胞周期依赖的激酶抑制因子。P16可以被致癌基因、DNA损伤和衰老诱发表达，引起细胞周期的抑制，加快细胞衰老。

研究表明，Sall2能够下调P16因子的表达，脊椎动物的Sall2蛋白分子具有4个独立或成群的锌指结构，分别是Z1、Z2、Z3和Z4。实验室已经构建了不同锌指结构缺失突变的质粒，本课题通过细胞转染、流式细胞仪和western blot等实验方法，探究Sall2的哪一个锌指结构作用在P16启动子GC区域，直接参与P16表达调控。

1. 研究手段

细胞转染、western blot、FACS

1. 主要成果形式
2. 阅读相关文献，了解Sall2和P16细胞因子的背景知识，熟悉国内外两种细胞因子抑制肿瘤生长机制的研究现状。
3. 掌握实验室常用的生物技术，特别是课题涉及的几种实验方法。
4. 比较突变质粒表达产物，得出结论。
5. 根据实验结果，撰写论文。
6. 主要参考文献

[1]Sal-like protein 2 upregulates p16 expression through a proximal promoter element. Zhenghua Wu, Kebin Cheng, Lidan Shi,Zheqi Li, Hema Negi,Guangwei Gao,Suchitra Kamle1and Dawei Li. Cancer Science. Volume 106, Issue 3, pages 253–261, March 2015.

[2] The tumor suppressor protein p150Sal2 in carcinogenesis. Chang Kyoo Sung amp; Hyungshin Yim. Tumor Biol. (2015) 36:489–494.

1. 本课题工作进度

1. 文献综述
2. Sall2研究进展

Sall2，也被叫做P150和hsal2，是一种的肿瘤抑制因子和多瘤抗原失活靶点。Sall2是一种锌指转录因子，有共同DNA结合序列GGG(T/G)GGG。所以Sall2属于一种GC盒结合蛋白，是转录因子Sp1家族成员。SALL2基因产生两种相似的蛋白，通过它的两种不同启动子，P1末梢启动子和P2临近启动子，产生可替换的的交互连接的蛋白，仅仅在它们的短N末端序列使用外显子1还是外显子1A有所不同。

Sall2通过多种方式抑制肿瘤形成，包括抑制病毒DNA复制，和结合肿瘤细胞中具有生长抑制和前凋亡功能位点来活化p21启动子。Sall2可能是胃癌的早期肿瘤标记物和卵巢癌的抑制因子。Sall2还在结直肠癌的生长中起到重要作用。在不同癌症中Sall2基因表达的表观遗传沉默与肿瘤形成有关。然而，Sall2调节细胞增殖的靶基因网络还没有被研究透彻。

Sall 2通过GC组件GGG（T/C）GGG连接到两个启动子，p21（Cipl/Wafl）和BAX，所以Sall2 被归类为Sp1家族转录因子。我们都知道Sp1能够通过结合P16转录因子中相应GC盒子正向调控P16转录。在这里，我们研究Sall2 调节的下游靶基因，通过活化特定的启动子来验证P16基因是否是Sall2 的直接下游靶点，从而增加我们对Sall2基因调节网络和Sall2负调控癌症潜在机制的理解。

多瘤病毒T结合P150蛋白

研究表明，在动物和细胞培养系统中的致癌病毒与人类癌症存在很大相关性。这种相关性源自于，病毒改变的宿主通路和各种癌症的通路之间的相关性，无论这一通路是否是由病毒诱导。鼠多瘤病毒系统被很多人认为是一种生命力顽强且易于处理的鼠癌症模型。全世界实验室数十年的研究已经揭示了这种病毒的基因和生化特性，特别是它们致癌的途径。被Py 诱导的被癌症改变的蛋白网络和多种癌症影响的其他网络相比有共同的特点，说明Py系统在肿瘤学中有广泛的适用性。

SALL2的下游位点

为了更好地理解P150介导的转录调控，顾等使用多种分子生物和生化检测，研究P150结合位点DNA序列特异性。这些实验说明：共同的结合位点是七核苷酸GGG(T/C)GGG。这些GC丰富的片段出现在P21和BAX启动子区域，在正常卵巢表皮上皮细胞中P150蛋白能够正向调节这个序列的表达。P150共同结合位点也出现在c-MYC致癌基因启动子区域，这一基因在多种癌症中频繁地过度表达。P150蛋白能够通过结合c-MYC启动子下调这一基因表达。这似乎是P150的一个通用功能。曾经有报道指出在恶性胶质瘤、肺癌、乳腺癌和卵巢癌中SALL2和c-MYC表达之间的逆相关性。

全基因组芯片分析用来识别诱导和维持人包皮纤维细胞沉默所必需的基因。研究显示，与生长限制有关的基因取决于SALL2基因的表达，虽然这些基因是否是P150的直接转导靶标还没有研究清楚，但是SALL2的启动子区域是否存在P150结合的共同序列，生长抑制条件下P150是否直接作用于它们，这两个问题仍具有研究价值。为了得到P150的完整下游靶点，也为了更好地理解P150介导的基因调节，我们必须开展基因组表达分析和染色质免疫沉淀测序和功能分析。

SALL2和肿瘤形成

有人提出，P150是肿瘤抑制因子，因为SALL2的表达在卵巢癌细胞、肺癌、结直肠癌、前列腺癌和急性髓性白血病中明显下降，通过P21CDK抑制蛋白和BAX促凋亡蛋白的增加表达，SALL2大量表达，降低了裸鼠卵巢癌细胞致瘤性。SALL2能够增加卵巢癌细胞和神经元细胞中P21启动子活性和P21蛋白表达。此外，P150是一种重要因子，人包皮纤维母细胞中生长因子耗尽时能够维持细胞周期。更重要的是，人卵巢癌细胞丧失了SALL2的表达，但正常卵巢细胞没有丧失。卵巢癌中P150的低浓度是因为DNA甲基化作用。SALL2启动子被超甲基化，造成SALL2基因沉默和大部分测试的肿瘤片段P150低表达量。这与其它肿瘤抑制因子很相似，包括P16，P15，PTEN，P53和RUNX3这些在肿瘤细胞中超甲基化时被沉默的基因。这些数据说明，P150具有抑制卵巢癌的作用。

SALL2和人卵巢癌

老鼠的多种组织免疫印迹显示，P150蛋白在大脑、肾和肺中有表达，但是观察到的最高浓度的表达是在卵巢组织中。进一步的免疫组织化学着色显示，P150在正常人卵巢表皮细胞中高度表达。相反，210例卵巢癌组织学检测结果中P150表达减少，90%的案例中P150表达丢失，说明P150在人卵巢中可能起肿瘤抑制因子的作用。已丢失P150表达的卵巢癌细胞中，P150表达的复位抑制免疫缺陷小鼠的肿瘤生长。除此以外，有报道称，SALL2基因位于与卵巢癌相关的染色体区域。

SALL2从可替换的P1和P2启动子开始表达，分别产生E1和E1A片段变体。人们发现，由P2启动子产生的E1A变体是正常卵巢表皮细胞表达的主要形式。P2启动子中存在许多CpG二核苷酸，表现出对甲基化沉默的敏感性。确实，我们对人卵巢瘤切片和培养的卵巢瘤细胞DNA样品进行重亚硫酸转化，进行焦磷酸测序，结果显示卵巢瘤中P150丢失是因为SALL2启动子的甲基化。

卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最致命的，预计每年会造成125000位女性死亡，并且长期存活率一直没有增长。最高等级的严重肿瘤都很常见，又具有最高的发病率和死亡率。人类肿瘤中重要的早期癌变前变化都存在表观遗传修饰。因为后期的变化是可以被逆转的，被启动子甲基化失活的基因也许能成为重要的治疗靶点。这个观点是，如果启动子区域CpG岛中甲基化核嘧啶能够被去甲基化，我们也许能阻止卵巢癌的恶化。因为在大多数人卵巢癌中，SALL2基因在启动子甲基化过程中被沉默，强迫它表达会造成OVCA细胞生长抑制和凋亡，卵巢癌组织SALL2启动子的去甲基化也许能造成P150的再表达，进一步抑制肿瘤细胞生长。核苷类似物包括氮胞苷临床上被用来当做启动子甲基化的抑制因子，但是它缺乏靶点特异性，分子活性周期太短，限制了它们在肿瘤治疗中的应用。DNA脱甲基酶能够识别沉默的SALL2启动子，通过启动子去甲基化活化基因。DNA脱甲基酶也许能成为抑制卵巢癌细胞生长的最佳候选物。但是，目前还没有鉴定出这些酶的成分。转录因子AP4靶向SALL2启动子进行正向调控。我们设想AP4融合去甲基化，这一物质也许能够成为一种可能的治疗分子，特异性地沉默SALL2启动子，让卵巢癌患者的SALL2基因再次表达。

1. P16研究进展

P16^INK4A是一种仅仅由四种锚蛋白重复序列组成的蛋白质，被公认为是一种肿瘤抑制剂，主要是因为它在几乎所有肿瘤中都能够灭活p16INK4A (or CDKN2A)基因，具有普遍性。但是，我们也发现P16表达增加（正调控）与细胞衰老、老化和癌症恶化有关，说明P16调节对它的功能有很大影响。这里，我们讨论了DNA级别、转录级别和转录后级别P16功能的调节机制，以及这一机制对P16构效关系和癌症的影响。

P16在细胞周期进程中有重要作用。在G1到S期过渡时期，P16特异性阻断细胞周期素依赖性激酶4和6（CDK4，CDK6）介导的pRb磷酸化（pRb是一种成视网膜细胞瘤易感基因产物），然后隔绝E2F转录因子成为没有作用的pRb/E2F复合物，最终阻断细胞周期。除此以外，人们证实，由致癌基因，DNA损伤应答和衰老诱导的p16表达升高能够激发和加速细胞衰老。因为我们在将近50%人类癌症中发现敲除、甲基化或点突变造成的p16基因（细胞依赖的激酶抑制因子2a,CDKN2A）失活，所以mRNA和蛋白级别的p16过表达也跟癌症包括成神经细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和口腔癌的预后不良有关。总而言之，这些发现表明，P16转录级别和平移状态对它介导细胞活性的总体能力非常重要。但是，目前大量研究都聚焦在定义不同癌症中p16的遗传或表观遗传状态，目的是研究癌症产生的分子机制，但是我们直到现在都没有理解P16本身的关键调节机制。

P16蛋白对抑制肿瘤、细胞衰老非常重要，所以P16基因调节机制已经成为过去十年的研究热点。虽然一些分子机制仍然需要继续探索，但是非常明显，P16基因转录经历多个级别的调控，大多数的这些调控与P16基因启动子中存在的各种各样的调控组件有关。

1. Ets结合位点介导的调控：众所周知Ets1和Ets2转录因子是Ras-Raf-Mek信号的下游靶点，这两种因子受到MARK介导磷酸化的活化。P16启动子-124到-85处存在一个保守的Ets结合位点。一旦结合，Est1和Est2能够激活p16启动子，诱导p16在人纤维母细胞中的表达升高。
2. E盒子介导的调控：Id1出来对Ets活性有影响，也影响E47反式激活活性。正如其他的bHLH蛋白（也称作E蛋白），E47包含HLH区域，主要介导与其它HLH蛋白的同源或异源二聚化，调节基因表达，结合的基本区域是一段相同的DNA序列CANNTG，被叫做E盒子区域。P16启动子中有两个E盒子组件，位于-349(CAGGTG)和-615（CAGGTG）。一旦E47与其它E蛋白同源二聚化或异源二聚化，E47结合到这两个E盒子组件，活化p16在衰老细胞中转录。
3. Sp1结合区域介导的调控：p16启动子GC丰富区域包含知识五个假定的GC盒子（-474到-447，-462到-435，-380到-355，-76到-49，-26到-1），代表Sp转录因子（包括Sp1,，Sp3，Sp4）假定的结合靶向区域。还有一份详细的记录表明，P16启动子还有一个正向转录调控组件（位置-462到-435），是Sp1的结合位点。
4. HBP1结合位点介导的调控：有报道显示，P16启动子有一个结合位点在-426到-433位置，结合HMG盒子包含蛋白1(HBP1)转录因子，是Ras-Raf-Mek信号通路的下游效应因子。HBP1 对于p16启动子的序列特异性结合正向调节P16表达，触发原代细胞的过早衰老。
5. ITSE介导的调控：p16启动子也有一段负向调控原件，INK4a转录沉默原件（ITSE），位置在-491到-485之间。当ITSE被敲除时，年轻的2BS细胞P16启动子显著活性增加。
6. AP1位置介导的调控：哺乳动物AP1蛋白是同源二聚体和异源二聚化，由基本区域亮氨酸拉链bZIP蛋白包括Jun蛋白（c-Jun，JunB，JunD），Fos蛋白，Jun二聚化伴侣（JDP1和 JDP2）组成，能够活化转录因子（ATF2，LRF1/ATF3和B-ATF）。鼠p16启动子中有三个AP1类似区域，包括-1189处TGACTGA，-783处TGACTTCA，-484处TGACACA。JunB的异常表达会诱导高浓度的P16蛋白，导致原代鼠纤维母细胞的过早衰老和3T3细胞中扩散减少。
7. PPRE介导的调控：在p16启动子-1023位置发现了过氧化酶体增生物反应原件（PPRE）。在血管平滑肌细胞（SMC）中，过氧化酶体增生物活化受体alpha;(PPARalpha;)通过诱导p16表达，负向调控细胞周期G1/S过渡期。
8. 其它非特异组件介导调控

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1. 目的

Sall2，也被叫做P150和hsal2，是一种的肿瘤抑制因子和多瘤抗原失活靶点，能够上调p16的转录和翻译，从而抑制肿瘤生长。本课题旨在探究Sall2锌指结构对p16表达上调作用的具体分子机制。

1. 研究内容

Sall2，也被叫做P150和hsal2，是一种公认的肿瘤抑制因子。Sall2能够结合DNA序列GGG(T/G)GGG，所以它属于一种GC盒的结合蛋白，是转录因子Sp1家族成员。P16，也被叫做MTS1和P16INK4A，是一种细胞周期依赖的激酶抑制因子。P16可以被致癌基因、DNA损伤和衰老诱发表达，引起细胞周期的抑制，加快细胞衰老。

研究表明，Sall2能够下调P16因子的表达，脊椎动物的Sall2蛋白分子具有4个独立或成群的锌指结构，分别是Z1、Z2、Z3和Z4。实验室已经构建了不同锌指结构缺失突变的质粒，本课题通过细胞转染、流式细胞仪和western blot等实验方法，探究Sall2的哪一个锌指结构作用在P16启动子GC区域，直接参与P16表达调控。

1. 研究手段

细胞转染、western blot、FACS

1. 主要成果形式
2. 阅读相关文献，了解Sall2和P16细胞因子的背景知识，熟悉国内外两种细胞因子抑制肿瘤生长机制的研究现状。
3. 掌握实验室常用的生物技术，特别是课题涉及的几种实验方法。
4. 比较突变质粒表达产物，得出结论。
5. 根据实验结果，撰写论文。
6. 主要参考文献

[1]Sal-like protein 2 upregulates p16 expression through a proximal promoter element. Zhenghua Wu, Kebin Cheng, Lidan Shi,Zheqi Li, Hema Negi,Guangwei Gao,Suchitra Kamle1and Dawei Li. Cancer Science. Volume 106, Issue 3, pages 253–261, March 2015.

[2] The tumor suppressor protein p150Sal2 in carcinogenesis. Chang Kyoo Sung amp; Hyungshin Yim. Tumor Biol. (2015) 36:489–494.