川贝母药材的DNA分子鉴定研究文献综述

川贝母为一种常用贵重的多年生鳞茎类药材，由于野生引种家种困难，很难规模化人工栽培，目前市场上出售的正品川贝母药材主要来源于野生资源。

全国各地由于用药习惯的不同，用作川贝母的原植物种类很多，加上商品川贝母的售价远高于贝母属其它贝母，市场上川贝母常出现混伪品，严重影响了用药的安全有效性，因此，川贝母类药材的基原鉴定是一项极为重要的工作。

传统的基于性状、显微或化学成分的鉴定方法缺乏专属性, 因此,建立专属性强并且可行性高的川贝母DNA分子鉴定方法具有重要意义。

本课题在前期研究工作的基础上，考察中国药典已收载的川贝母的PCR-RFLP鉴别方法耐用性，以期对川贝母的质量控制提供参考。

　　二、研究方法和技术路线1. 川贝母干药材基因组DNA模板提取 取本品0.1 g经75 %乙醇和灭菌超纯水清洗，干燥后在研钵中研磨成极细粉，取20 mg置1.5 mL离心管，按新型植物基因组DNA快速提取试剂盒提取DNA模板。

2. PCR-RFLP反应　　引物：5CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3和5GCTACGTTCTTCATCGAT3。

PCR反应体系：在200 mu;L 离心管中进行，反应总体积为30 mu;L，反应体系包括10 PCR 缓冲液3 mu;L，dNTP（2.5 mmol/L）2.4 mu;L，引物（10 mu;mol/L）各1.5 mu;L，Taq DNA聚合酶（5 U/mu;L）0.2 mu;L，模板2 mu;L，无菌超纯水19.4 mu;L。

将离心管置PCR仪中，PCR反应参数：95 ℃预变性4分钟，循环反应30次（95 ℃ 30 秒，55~58 ℃ 30 秒，72 ℃ 30 秒），72 ℃延伸5分钟。

取PCR反应液进行酶切反应，在500 mu;L离心管中进行，反应总体积为20 mu;L，反应体系包括10 T Buffer 2 mu;L，0.1% BSA 2 mu;L ，PCR反应液6 mu;L，Sma I（10 U/mu;L）0.5 mu;L，无菌超纯水9.5 mu;L，酶切反应在30 ℃水浴中进行2 小时。

3. 电泳检测照琼脂糖凝胶电泳法（中国药典三部附录Ⅵ B），胶浓度为2 %，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRad；供试品酶切反应液的上样量为8 mu;L，DNA分子标记上样量为5 mu;L。