金雀异黄素衍生物GEN-27通过 β-catenin通路对结肠癌细胞增殖的抑制作用文献综述

1. 拟研究的问题

世界范围内高达15 %的恶性肿瘤源于感染，每年全球总计可达120 万例。许多慢性炎症环境使得被感染组织发生癌变的危险程度增加。在小鼠的炎癌模型中更明确的证明炎症所造成的微环境有利于癌症的发生和发展。因此, 慢性炎症是导致肿瘤发生的一个重要因素。

研究证实p65、CDX2、beta;-catenin是炎性细胞促癌作用的关键节点。本课题组首次发现了金雀异黄素衍生物GEN-27对结肠癌的化学预防作用，其机制可能是通过调控p65-CDX2-beta;-catenin通路。本项目拟研究的问题如下：

1. 金雀异黄素衍生物GEN-27对结肠癌的预防作用；

2.该预防作用可能是通过调控p65-CDX2-beta;-catenin通路；

3.进行功能团改变后的GEN-27衍生物的构效关系评价，指导目标化合物的合成，最终得到机制明确的基于炎癌转化的肿瘤化学预防药物。

1. 研究手段

1） real time PCR 和Western Blot 方法：Trizol法提取总RNA，分离mRNA，设计引物，用Superscript II reverse transcriptase 和 oligo-dT primers合成First-strand cDNA。 PCR 反应由100ng cDNA, 50 nM 各引物, 和SYBR Green master mix 组成。 real-time PCR 在 Applied Biosystems PRISM 7900HT Sequence Detection System上进行，得到的数据用SDS 2.0 软件处理；提取蛋白、电泳分离样品，结束后转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），用含3%BSA的PBST 封闭，分别与不同一抗反应，再和二抗反应，曝光、显影、定影，进一步分析蛋白表达水平的变化。

2）染色体免疫共沉淀（CHIP）：收取一定量细胞，甲醛交联，超声破碎，离心除去不溶物质， 留取300 ul做实验，其余保存于-80度。 300 ul中，100 ul加相应抗体做为实验组；100 ul不加抗体做为对照组；100 ul加入4 ul 5 M NaCl （NaCl终浓度为0.2 M），65度处理3 h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。在100 ul的超声破碎产物中，加入900 ul ChIP Dilution Buffer和20 ul的50times;PIC。 再各加入60 ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。免疫复合物的沉淀及清洗。孵育过夜后，每管中加入60 ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA，4度颠转2 h。4度静置10min后，700 rpm离心1min。除去上清。依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700 rpm离心1min，除去上清。 清洗完毕后，开始洗脱，混匀，65度解交联过夜，解交联结束后，每管加入1 ul RNaseA（MBI），37度孵育1 h。

每管加入10 ul 0.5M EDTA，20 ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2 ul 10 mg/ml 蛋白酶K。 45度处理2 h。利用omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100 ul ddH2O，设计对应引物，PCR分析。

3）转染：利用质粒转染技术，构建目的基因表达质粒，转染至肿瘤细胞中，实现对目的基因的过表达。用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000,按试剂盒说明进行操作。real-time PCR和Western Blot检测转染前后细胞中目的基因mRNA和蛋白的表达。

4）Transwell共培养模型建立：将Transwell insert倒置于无菌培养皿中,在其PET膜(0. 4mu;m孔径，10mu;m厚) 的下室面滴加肿瘤细胞悬液( 10⁷个/膜)后一并放入无菌铝盒中，置入37℃、5%CO2的培养箱中。6 h后翻转Transwell insert放入6孔培养板中，下室加入1. 5 ml/孔的含10%胎牛血清的DMEM培养基后放回培养箱中继续培养。待肿瘤细胞达60%融合后在上室中加入THP-1细胞悬液( 10⁸个/膜)继续培养。每天更换Transwell培养系统上下室的培养液，共培养至少3d。