LC-MS/MS法检测人血中羧甲基赖氨酸的浓度文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一．课题的立项依据

最新流行病学资料显示，我国已超越印度成为世界第一大糖尿病国家（现有9240万糖尿病患者和14820万糖尿病前期患者），每年因糖尿病及其并发症而造成的直接经济损失就高达260亿美元，占全国医疗费用总支出的18.2%。在糖尿病致死致残的重要并发症中，加速性动脉粥样硬化以其发生时间早、进展快、累及范围广、预后差等特征而倍受医疗界和学术界重视。本课题组多年的系统研究及国内外相关研究均证实，糖尿病加速动脉粥样硬化（Atherogenesis,AS）主要病因是蛋白质和脂质的非酶糖化，形成不可逆的糖基化终产物（Advanced Glycation End-Products,AGEs）在血管壁细胞间隙和细胞内的蓄积， AGEs通过非受体介导和受体介导的机制与血管壁发生相互作用、触发炎症增殖反应、传播炎症和扰乱血管壁功能来加速AS发生发展。

既往研究表明，AGEs与DM血管并发症有着密切联系，但其发生发展的机制近年来才有较详细的研究。AGEs主要通过两个途径对机体产生损伤：第一种是非受体途径，如细胞外蛋白质、胶原、脂质等的糖化和交联，引起组织基质结构发生改变：AGEs可以直接捕获蛋白质，使蛋白质间产生交联，影响其结构及功能，并影响发挥正常功能及维持组织完整性所必需的细胞间联系；AGEs与基底膜上Ⅳ型胶原产生交联，影响网络结构的形成，破坏血管的正常结构及功能；生物半衰期较长的胶原经历了非酶糖基化，将很大程度地降低血管壁弹性；AGEs可糖基化低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL），上调血管内皮细胞纤溶酶原激活物抑制剂的水平，导致血管功能紊乱及血栓形成；AGEs还可诱发氧化应激过程，使氧化型LDL加速产生，使之与趋化至内皮下的巨噬细胞表面的清道夫受体相结合，加速泡沫细胞生成，致使早期脂纹形成；AGEs可糖基化高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），降低自身逆转运胆固醇的能力，加速脂质沉积在血管壁，诱导动脉粥样斑块形成。

另一种更为重要的是受体途径，即通过与细胞膜表面特异性受体晚期糖基化终产物受体(Receptor for AGEs，RAGE)的相互作用，激活细胞内部各种信号转导机制，引起细胞结构及功能的改变。目前认为蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase，PTK）、P21RAS、细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-kinase1/2，ERK1/2）、氧自由基、p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、核因子kappa;B（nuclear factor-kappa;B，NF-kappa;B）构成AGEs-RAGE介导的信号转导途径。AGEs在血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞等与RAGE相结合，可诱导多种细胞因子及氧自由基的产生，从而改变细胞外基质通透性，改变内皮细胞抗血栓性能，改变血管壁调控血管张力的能力，引起血管内皮损伤、血液流变学和血流动力学异常、细胞基质异常增生及新生血管形成障碍等一系列病理变化，从而促进DM的各种血管并发症，尤其是AS的发生与发展。

如何降低动脉粥样硬化斑块体积，稳定斑块阻止其钙化及破裂脱落是预防急性心肌梗死、脑梗死和血管撕裂等心脑血管事件发生的关键。既往的研究发现，即使LDL-C降低到80mg/dl以下，仍有相当比例的患者发生心血管事件，发现LDL-C降低水平与患者斑块体积变化及斑块逆转不成相关性。最近的血管内超声研究发现，血管壁重塑与斑块的稳定性、炎症和疾病的进展相关，他汀药物治疗过程中可以逆转板块进展，增加斑块的稳定性，这一效应独立于他汀降低LDL的药效；研究已证实炎症和血脂异常是AS发生发展的关键因素，单变量分析发现CRP9(C反应蛋白)的减少与AS的进展密切相关；所以他汀药物逆转稳定斑块的药效可能与其抗炎、抗氧化等药物多效性有关（Pleiotropic effects）。基于糖尿病患者，AGEs是通过过度增加氧化应激和炎症反应来加速AS的发生发展，我们提出假设：AGE-RAGE可能是他汀药物的新靶点，他汀药物可以通过调节AGE-RAGE来达到抗炎抗氧化稳定斑块的作用。

他汀药物对AGE的影响？

他汀药物发挥其降低LDL药效的靶器官主要是在肝脏，但是发挥稳定板块降低炎症反应、阻止AS发生发展药效的靶器官主要是在动脉壁的粥样硬化板块组织中，所以我们猜测动脉壁组织可能是他汀药物发挥药效的另一靶组织。他汀药物进入靶组织方式主要有被动扩散和主动扩散，影响被动扩散的因素是药物的亲脂性（LogD值），影响主动扩散的因素是靶组织细胞膜上的药物转运蛋白和药物的亲脂性。靶组织中游离药物浓度是决定用药安全性，发挥最大药效，避免出现毒性反应的关键。

由于他汀药物种类繁多，分子结构和理化性质的不同，导致：①不同他汀药物对同一靶组织的选择性及受体亲和力（K_d值）不同；②不同的靶组织表达药物的转运体也不同；因此导致在最大安全剂量下，有些他汀药物不能在靶组织中达到有效治疗浓度。针对糖尿病患者具有加速AS发生发展的病情，选择在平滑肌组织高暴露，及与其受体亲和力高的他汀药物尤为重要。已有研究证实了不同他汀药物的LogD值和其所对应的药物转运体，及他汀药物在不同组织中的分布，至今还没有人研究不同他汀药物在动脉壁组织中的分布及他汀药物进入血管壁平滑肌细胞的机制。

因此，本实验预研究普法他汀、匹发他汀和辛伐他汀在靶组织血管壁（内皮细胞和平滑肌细胞）中的浓度与新治疗靶点AGEs－RAGE效应之间的关系，进一步了解不同他汀药物在靶组织血管壁中的分布，及其他汀药物稳定板块预防心血管事件发生的药效机制，建立基于机制的他汀药物PBPK/PD模型，提出针对性的预防心血管事件发生的治疗策略，以便更好的指导临床用药。

二、采用的研究手段：

生物样品分析方法

由于羧甲基赖氨酸为内源性物质，且游离型羧甲基赖氨酸在血浆中浓度很低，故选择采用LC-MS/MS检测法测定人血浆中羧甲基赖氨酸浓度。以氘代羧甲基赖氨酸为内标，正离子检测，多反应监测（MRM）的质谱扫描方式，羧甲基赖氨酸和内标的离子对m/z分别为m/z 205.2→130.10；207.2→84.10，保留时间均在3.90min左右。研究报告中提供了典型的空白血浆样品、空白血浆样品加入标准品、用药后血浆样品的色谱图，证明血浆其它内源性物质不干扰羧甲基赖氨酸的测定。血浆中羧甲基赖氨酸的标准曲线范围为10ng/ml～1000ng/ml，线性范围覆盖全部待测浓度。定量下限为10ng/ml，6份定量下限血浆样品的精密度（RSD）为2.35%。低、中、高浓度（20 ng/ml、120 ng/ml、800 ng/ml）样品中羧甲基赖氨酸的提取回收率分别为99.29%、99.34%和98.35%。低、中、高浓度的日间和日内变异（RSD）均小于13.76%。上述三个浓度血浆样品中羧甲基赖氨酸的基质效应分别为91.15%、93.86%和98.4%，说明血浆中基质对于CML样品测定的有恒定的抑制作用。生物基质对氘代羧甲基赖氨酸几乎没有作用。稳定性考察表明羧甲基赖氨酸的血浆样品处理后即可进样、血浆样品进样架放置24h、血浆样品室温放置24h、反复冻融3次和长期冷冻（-20℃）15天稳定，羧甲基赖氨酸储备液稳定，内标氘代羧甲基赖氨酸储备液稳定。

进行血浆样品分析测定时，分析了三个人群，建立了随行标准曲线，提供了随行标准曲线的数据，结果表明线性良好。随行测定低、中、高三个浓度的QC样品共2个，合格质控样品总数大于未知血浆样品总数（28个）的5%，患者血浆样品浓度测定结果有效。

三．文献综述

A．糖基化终产物（AGEs）背景资料

AGEs主要通过两个途径对机体产生损伤：第一种是非受体途径，如细胞外蛋白质、胶原、脂质等的糖化和交联，引起组织基质结构发生改变

另一种更为重要的是受体途径，即通过与细胞膜表面特异性受体晚期糖基化终产物受体(Receptor for AGEs，RAGE)的相互作用，激活细胞内部各种信号转导机制，引起细胞结构及功能的改变。

B.色谱条件调研：

色谱条件

色谱柱：Lichrospher NH₂，2.1mm150mm,5mu;m（汉邦）, Ser No.07051102

柱温：38℃。

流动相：A相:超纯水， B相:乙腈，梯度洗脱。

流速：0.2mL/min。

梯度洗脱流程：

LC停止时间：6.0min；3.5min~5.0min进质谱。

2.4 质谱条件

离子检测方式：多反应监测（MRM）的质谱扫描方式

离子极性：正离子

离子化方式：电喷雾离子化

检测对象：检测离子对分别为 CML m/z 205.2→130.10；CML-d2(内标) m/z 207.2→84.10。

Source/Gas：NEB:12，CUR:12，CAD:12，IS:5500，TEM:500

Compound：CML（DP:38，FP:140，CE:18，EP:10，CXP:16），CML-d2（DP:32，FP:194，CE:34，EP:11，CXP:6）。

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