麦冬皂苷结合蛋白抑制剂对TNF-α诱导HUVEC细胞TF表达的作用研究文献综述

拟研究或解决的问题：

本课题拟考察麦冬皂苷结合蛋白抑制剂(blebbistatin)能否有效抑制TNF-alpha;诱导HUVEC细胞中TF的活性与表达，并初步探讨可能的作用机制，为Blebbistatin防治血栓提供一定的实验参考依据。

采用的研究手段：

（1）TNF-alpha;诱导HUVEC细胞中TF的活性与表达

HUVEC细胞用1040培养基培养，以1106cell/mL的细胞密度接种于96孔培养板（150mu;L/孔），37℃、5%CO2培养24h。吸取培养基，换成无血清1640培养基，平衡2h。实验分为三组：①空白对照组：先加入90mu;L的无血清1640培养基1h，再加入10mu;L1640培养基；②模型组：先加入90mu;L的无血清1640培养基1h，再加入10mu;LTNF-alpha;（终浓度为10ng/mL）孵育5h，以刺激TF的表达；③给药组：先加入90mu;L不同浓度药物（1.0,0.1,0.01三个剂量）作用1h，再加入10mu;L（10ng/mL），共同孵育5h。

（2）改良的发色底物法测定TF活性

药物与TNF-alpha;共孵育5h后，将细胞板内培养基吸去，每孔加无血清1640培养液100mu;L，－70℃至室温反复冻融3次，使细胞裂解，将裂解液吹打均匀，吸取45mu;L接种于另一新的96孔板中，37℃温育5min，加入新配制的人凝血酶原复合物（PPSB）溶液（5mu;L/孔），37℃温育15min，再加入新配制的发色底物溶液50mu;L，温育3min，用酶标仪在405nm测定吸光度。

（3）Western法测定TF的表达

等量加入细胞裂解液后，提取HUVEC细胞的蛋白，4℃裂解30min。离心去上清液。用BCA蛋白试剂盒测定蛋白质的含量。之后剩余的裂解液按1/5的体积加入loadingbuffer煮蛋白。再用10%SDSPAGE分离样品蛋白并转移到PVDF膜，膜由3%牛血清白蛋白(BSA)封闭并且由初级抗体孵化。然后由山羊、兔、鼠的抗体结合辣根过氧化物酶作为次级抗体孵化2h。免疫反应带由化学发光系统(ECLplus,Amersham)检测。

（4）RT-PCR法测定TFmRNA的表达