Reg4蛋白单链抗体的表达及其活性的研究文献综述

课题名称: Reg4蛋白单链抗体的表达及其活性的研究课题性质 radic;基础研究一、拟研究或解决的问题：目前对Reg4 蛋白的研究主要局限于促细胞增殖、抗凋亡以及在胃肠肿瘤中的作用和机制。

近年来研究表明Reg4 蛋白与胰腺癌密切相关，血清Reg4 蛋白水平作为胰腺癌诊断和预后的靶标具有极大优越性，而国内外学者还未涉足以封闭Reg4 蛋白功能为手段，抑制胰腺癌细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡等方面的基础性研究。

anti-Reg4 scFv 做为新一代的基因工程抗体，易于纯化，可特异性封闭肿瘤细胞高表达Reg4 蛋白。

scFv是一种只含可变区而不含Fc效应端的小分子抗体，所以它保留了可识别Reg4的特异性，但又不引起抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC），从而封闭抗原表面活性位点，抑制Reg4 蛋白的作用，它有可能有效抑制肿瘤细胞增殖和迁移，降低耐药能力，增进癌症治疗效果。

目前已通过重组技术制备出Reg4蛋白，并且通过噬菌体展示技术，从抗体库中筛得抗Reg4蛋白单链抗体，也通过基因工程技术得到含单链抗体的工程菌，本课题通过接种发酵和一定的纯化技术得到目的蛋白，并运用生物素化标记及生物膜层干涉技术BLI（Bio-layer Interferomet RY)检测亲和力。

同时，构建Reg4蛋白过表达胰腺癌PANC-1细胞，在细胞模型中研究抗Reg4蛋白单链抗体抑制胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移，降低肿瘤细胞对药物耐受的作用。

二、研究手段：1、anti-Reg4 scFv 的构建。

先通过抗体的噬菌体筛选技术获得anti-Reg4 scFv的基因，通过PCR、双酶切和连接，将anti-Reg4 scFv基因插入pET22b质粒中，经过化学转化法，将构建的anti-Reg4 scFv-pET22b质粒转化入BL21 E.coli中，经过PCR验证及测序验证正确后，用IPTG进行诱导表达，anti-Reg4 scFv以细胞周质分泌形式表达。

2、anti-Reg4 scFv的表达与纯化经过划线平板培养得到BL21 E.coli的单菌落，经过两级放大培养及IPTG诱导得到菌体的发酵液，超声破碎、离心、抽滤得到粗的单链抗体样品，将样品通过镍柱层析柱进行纯化，收集洗脱液就得到纯化好的单链抗体样品溶液。

3、生物素化、BLI技术检测anti-Reg4 scFv的亲和力 将抗Reg4单链抗体吸附在生物膜上，将Reg4蛋白进行生物素化后加到生物膜上，抗原抗体结合后，插入联合有亲和素的探针进行放大反应，再通过 BLI技术检测亲和力的大小。