多巴胺D5受体激动剂高通量筛选文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

研究背景

多巴胺是中枢神经系统中重要的神经递质，它能够控制认知、情感、运动和内分泌[1]。多巴胺受体主要分布在大脑皮层、纹状体、外侧丘脑、黑质、前额叶区及海马回等处，它属于7次跨膜超家族G蛋白偶联受体中的一员，通过与多巴胺受体作用可以发挥重要的生理作用。该受体激活后通过Gs蛋白调节能够激活腺苷酸环化酶（Adenylylcyclase,AC），升高细胞内3,5-环磷酸腺苷（3,5-cyclicadenosinemonophosphate,cAMP）的水平，在中枢神经系统中起着广泛的作用。G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptor,GPCR）作为药物靶点约占药物开发靶点的45%左右，是重要的药物靶标。根据偶联受体不同，GPCR可以介导不同的信号通路，大约80%的激素、神经递质是通过GPCR进行信号传导[2]。

根据多巴胺受体与G蛋白结合后的信号转导通路不同，可以将其分为D1样受体和D2样受体，多巴胺D5受体（DopamineD5receptor,DRD5）属D1样受体的一个亚型。多巴胺D5受体对内源性多巴胺的亲和性是D1受体的10倍，这表明D5受体对其神经元活动性具有更重要的意义[3,4]。研究显示该受体激活后通过与Gs蛋白偶联进行信号通路传导，可激活腺苷酸环化酶（Adenylylcyclase,AC），从而提高细胞内环磷腺苷（CyclicAdenosineMonophosphate,cAMP）的产生，进而激活蛋白激酶A（ProteinkinaseA,PKA），使其发挥一系列生理效应[5]。

多种研究发现多巴胺D5受体在记忆过程和认知，空间学习中发挥着重要作用[6]，多巴胺D5受体激活后可阻止Abeta;低聚物引起的海马神经元树突AMPA和NMDA受体减少及突触功能障碍，同时可以降低由Abeta;沉积引起的海马切片长时程增强效应（Longtermpotentiation,LTP）损害程度[7.8]。此外，多巴胺D5受体还可调节D1受体介导的生理效应，这提示多巴胺D5受体对神经精神疾病的发生与防治起着重要作用[9,10]。Kumar等发现AD病人前额叶中唯一增多的多巴胺受体亚型是D5受体，且D5受体在星形胶质细胞中的含量增加较在前额叶中增加的更高，这提示多巴胺D5受体的代谢及调节与阿尔茨海默症（Alzheimersdisease，AD）这类认知功能障碍疾病的预防、发病及防治有一定关联[11,12]。所以本实验以多巴胺D5受体为研究靶点，旨在运用更合理的方法筛选具有其激动活性的化合物。

随着自动化技术的快速发展，高通量筛选技术在药物筛选领域得到了广泛应用。本实验将采用高通量筛选（HighThrough-putScreenning,HTS）技术进行活性化合物的筛选。在分子或细胞水平的实验方法为基础前提下，HTS以微孔板作为实验工具载体，采用自动化操作系统和快速灵敏的检测仪器采集实验数据并利用计算机分析处理数据，可在同一时间检测数以千万的样品，并获得大量有价值的信息的技术体系。与普通药物筛具有工作量大、耗时长、灵敏度低等缺点相比，HTS具有微量、快速、灵敏和准确的使用特点[13]

基于受体的高通量筛选模型包括标记配体与受体的相互作用，检测功能反应，测定第二信使生成等不同类型。常用于高通量筛选的第二信使主要包括：cAMP，Ca2 ，IP3等。根据GPCR介导信号通路不同，选择不同的检测指标，通常cAMP用于通过Gs或者Gi途径进行信号传导的GPCR检测，而Ca2 和IP3适用于Gq蛋白介导的GPCR检测。本论文所选多巴胺D5受体通过Gs蛋白介导的信号通路，所以选择cAMP作为检测指标。

目前，通过检测cAMP来筛选药物的技术有很多，如均相放射免疫闪烁迫近分析法，报告基因技术，极化荧光检测技术，LANCEcAMP方法等[14.15]。其中，LANCEcAMP是一种均相时间分辨荧光共振能量转移(Time-resolvedfluorescenceresonanceenergytransfer,TR-FRET)免疫分析方法，可以定量检测出药物刺激GPCR后胞内cAMP含量的变化。此方法基于Eu标记的cAMP示踪复合物与样本中的cAMP竞争标记了染料AlexaFuor647的cAMP抗体特异结合位点而进行定量测定。Eu标记的cAMP由Biotin-cAMP(b-cAMP)与streptavidin标记的Eu-W8044chelate(Eu-SA)组成，当抗体与Eu标记的cAMP示踪复合物结合，可在665nm处检测到强发射光，反之若抗体与样本中的cAMP结合，则665nm处检测到发射光较弱，即样本中cAMP含量与信号强度成反比。LANCEcAMP方法灵敏度高、信号值稳定，室温下放置20h灵敏度不变，所以适合于高通量筛选。

实验目的：以复苏后至少传代3次并达到稳定生长的细胞为基础建立稳定可靠的多巴胺D5受体激动剂高通量筛选模型，利用LANCEcAMP法对化合物库的小分子化合物进行筛选出具有D5受体激动作用的活性化合物,为多巴胺D5受体激动剂的进一步研究做出实验基础。

预期成果：本实验以稳定转染了多巴胺D5受体的CHO细胞为基础，应用以TR-FRET技术为检测平台的LANCEcAMP方法，建立了多巴胺D5受体激动剂高通量筛选模型，然后对符合要求的化合物进行筛选，最终得到一系列具有D5受体激动活性的先导化合物。