NMDA型谷氨酸受体在精神类疾病相关脑环路中的功能研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

1. 研究背景及意义

NMDA受体是一种谷氨酸门控的离子通道，介导兴奋性突触传递从而支配多种神经活动。结构上，NMDA受体通过组装成四聚体发挥作用，主要由两个GluN1和两个GluN2或GluN3亚基组成。其中，GluN2亚基有2A、2B、2C、2D四种亚型，GluN3亚基有3A和3B两种亚型。目前认为含有GluN3亚基的NMDA受体是以两种形式存在，二聚体（GluN1/GluN3）和三聚体（GluN1/GluN2/GluN3）。NMDA受体亚基的表达模式具有时空特异性，即亚基表达随发育变化且在不同脑区分布不同。其中NMDA受体的必需亚基GluN1，在胚胎期以及成年期的中枢神经系统中均有着广泛的表达。GluN2A在出生后开始表达并逐渐增加，成年后在整个中枢神经系统中广泛分布。GluN2B胚胎期开始表达，在出生后7-10天其表达量达到顶峰，之后稍有降低但仍维持在较高水平，而其在脑区的分布随发育进行，逐渐局限于皮质、海马体等脑区。GluN2C在生长发育过程中出现较晚，大约在出生后10天开始表达，且主要在小脑和嗅球进行表达。GluN2D胚胎期开始表达，在出生后急剧下降，在成年期中枢神经系统中，GluN2D只在间脑和脑干有微弱的表达。此外，GluN3A与GluN3B呈现相反的表达模式，其中 GluN3A在出生后早期达到顶峰值，成年期降至低水平。相比之下，GluN3B在出生后一直处于较低水平，之后逐渐增加直至成年期达到峰值。

GluN1 亚基是NMDA 受体的功能型亚基，仅仅由GluN1 亚基即可组成有功能的NMDA受体通道，但是活性很低，因此在生理状态下需要结合调节型亚基。在皮层和海马体中的NMDA受体的亚型可以是二聚体即GluN1/GluN2A和GluN1/GluN2B，也可以是三聚体即GluN1/GluN2A/ GluN2B。GluN1 亚基与不同的GluN2 亚基构成不同的NMDA 受体，在诸如通道动力学、与激动剂的亲合性、对Mg2 阻滞作用的敏感性、对不同离子的通透性以及胞内偶联蛋白等各种生理、药理特性方面有着较大的差异。GluN1 / GluN2A受体与GluN1 / GluN2B受体相比，有着较快的通道动力学特性，即衰减时间较短，具有更高的通道开放概率，以及受体的运动性较差，移动范围较小，比较稳定等。

NMDA受体作为一种介导兴奋性传递的离子通道，除了在突触的发育和可塑性中发挥着重要作用外，诸多研究中都有报道，NMDA受体的功能异常（即其功能低下或极度活跃）与多种神经系统疾病相关。如阿尔茨海默病中，Abeta;通过含有GluN2B亚基的NMDARs使突触的功能和可塑性发生改变，而GluN2B的拮抗剂可以补偿Abeta;诱导的LTP的损伤；在亨廷顿病中，含有GluN2B亚基的NMDARs的激活，增加了Huntingtin突变蛋白诱导的兴奋性毒性，从而造成神经元的死亡；此外精神分裂症的发病也越来越多地被认为与NMDA受体功能低下有关。

PSD-95（postsynaptic density protein 95）即突触后致密蛋白，相对分子质量为95 KDa，是突触后膜上最重要、最丰富的脚手架蛋白，主要存在于成熟的兴奋性突触内。PSD-95有着重要的功能，它是突触后膜上受体活动和稳定性维持所必需的，在突触可塑性中也发挥着重要作用，如参与调控发育期突触的数目，促进突触的形成等。有相关研究发现，PSD-95与NMDA受体的亚基GluN2A之前存在相互作用，由此暗示PSD-95也可能与精神类疾病中脑环路的功能异常相关。

综上，NMDA受体与PSD-95在脑环路中发挥着重要的功能，其功能异常与诸多精神类疾病相关。GluN1作为NMDA受体的必需亚基，能够通过其胞内羧基端与下游蛋白相互作用从而参与到一系列信号通路中。而目前对于GluN1和PSD-95两者是通过与那些蛋白相互作用来履行功能还有待研究。这一问题的阐明，会加深完善我们对于NMDA受体功能的了解，以及为探究NMDA受体与精神类疾病发病机制和寻找新的药物靶点提供新的思路。

1. 研究目的及相关研究手段

本课题将关注点放至两类重要的突触蛋白GluN1与PSD-95上，利用APEX邻近标记技术来研究与突触蛋白相互作用的蛋白组。具体可细分为：构建同时表达APEX和突触蛋白融合蛋白的表达载体；在细胞中验证融合蛋白的表达；在细胞中同时共表达连有APEX的突触蛋白及已知与该蛋白存在相互作用的蛋白，验证APEX的标记能力。在以上项目完成情况下，再尽可能开展以下工作：构建病毒表达质粒；病毒包装：包装连有APEX的突触蛋白的病毒，使其在神经元中过表达；利用病毒侵染，在神经元中过表达连有APEX的突触蛋白，探究神经元内与GluN1和PSD-95相互作用的蛋白组。

本课题主要的研究手段为APEX邻近标记技术。APEX全称为engineered ascorbic acid peroxidase，即工程化抗坏血酸过氧化酶。将表达APEX的活细胞与生物素-苯酚探针孵育若干时间，然后用1mM H₂O₂处理短时间以引发生物素化。APEX催化生物素-苯酚单电子氧化形成生物素-苯氧基，生成的生物素-苯氧基会将生物素共价标记到近端的内源性蛋白上。再利用链霉亲和素磁珠将生物素标记的蛋白沉淀下来，将其洗脱，再进一步以SDS-PAGE及质谱等方法对于这些标记蛋白进行进一步的分析研究。

1. 文献综述

NMDA受体亚基在不同脑区分布不同，并且随发育阶段的不同而发生改变(图1)。GluN1在大脑内广泛分布并贯穿发育的整个阶段，且GluN1的表达随着海马的发育逐渐上升，在出生后3周达到峰值，然后平稳下降，最后维持在一个较高的水平(Henson M A et al., 2008)。GluN2在胚胎期主要表达GluN2B和GluN2D，且GluN2B占主导地位，其中GluN2B在大脑皮层都有分布，而GluN2D主要分布在间脑和脑干。出生后，GluN2A开始表达并稳定增加，在3-4周其表达达到一个稳定的量；而GluN2B在出生后开始下降然后维持在一个稳定水平；GluN2C在出生后10天开始表达，主要分布在小脑和嗅球。GluN3亚基表达于正在发育的中枢神经系统，不参与谷氨酸离子通道的激活。胚胎期，GluN3A表达较低，但在出生后其表达快速上调，而在成年时又逐渐下降；GluN3B亚基的表达随发育缓慢上升，主要存在于运动神经元中(Pachernegg et al., 2012)。

图1：NMDA受体亚基组成及其分布随发育的变化。P0：GluN2B表达较多，GluN3A表达较少。P14：GluN2A的表达逐渐增加且分布广泛；GluN2C主要在嗅球和小脑表达。Adult：皮层和海马区主要表达GluN2A和GluN2B (Paoletti et al., 2013)。