诺如病毒特异性抗原的基因工程制备及鉴定文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

本课题的意义、国内外研究状况、应用背景

诺如病毒（Norovirus，NoV）是引起人类非细菌性急性胃肠炎的主要的病原体之一，可导致严重的公共卫生问题^[1]。病毒的直径约26~35mm，表面粗糙，无包膜，是二十面体对称状。电镜结果显示其表面缺乏杯装凹陷而仅有小凹痕，属于杯装病毒可科，诺如病毒属，有高度感染性。该病毒最早是在1972由美国学者Kapikian^[2]通过免疫电镜检出。相关数据统计，有超过85%的非细菌性胃肠炎是由诺如病毒引起的^[3]。主要症状是恶心、剧烈呕吐、腹部绞痛、腹泻、发热等。它所引起的腹泻，有传播速度快、发病急、设计范围广等特点，粪-口途径是主要的传播方式，也能够通过污染的水源、食物及病人呕吐物和粪便形成的气溶胶等形式传播。感染对象主要是成人和学龄儿童。全年均可发生感染，秋冬季为高发期^[4]。诺如病毒感染的潜伏期约为10~51h，最短10h，最长72h，其感染症状一般较为温和，但也会引发一些免疫抑制患者的死亡^[5]。由于其影响范围广且出现有高度变异、具有传染性和抵抗力的重组株，因此研发安全有效的诺如病毒疫苗极为重要。NoV基因是单股正链RNA，全长7.3~7.7Kb，包括三个开放阅读框（open reading frames，ORF）、3rsquo;端非编码区和poly A区，其中ORF1编码非结构蛋白，翻译和修饰后成6个功能蛋白。ORF2编码的衣壳蛋白是NoV抗原的主要决定簇，且与体结合，是近来研究的热点^[6-8]。ORF2编码的蛋白有三类，大小分别是46kDa、50kDa和58kDa，58kDa的蛋白是NoV完整的衣壳蛋白，它可被切成34kDa大小的蛋白，同样有反应原性。根据诺如病毒的RNA多聚酶区和衣壳蛋白区的核苷酸序列，将NoV分为5个基因组GI，GII，GIII，GIV，GV。GII型是最主要的亚型，占比82.4%。感染人类的主要是GI，GII，GIV。根据ORF2全基因序列，GII共有17个基因型，其中最常见的基因型是GII-4，约占44.6%，GII-4也一直是世界范围内诺如病毒流行的最主要基因型。一般来说，GII-4的核酸变异大约为10%，这成为限制诺如病毒免疫保护的重要原因。但目前有研究发现，一些GII-4基因型金华导致产生的配体改变和抗原变异的新种毒株^[9]。目前部分地区GII-17变异株出现了爆发流行趋势^[10]，且在部分地区有超越GII-4成为优势毒株的形式，但大部分地区，GII-4仍然是优势基因型^[11]。

诺如病毒因具有较高的传染性，因此快速、准确的诊断对预防和控制疾病的转播具有重大意义。目前有的诊断方法有直接电镜法和免疫电镜法（immuno-electron microscope，IME）等。但是直接电镜法要求病毒载量大，且其在电镜下形态学特征并不明显，因此检测结果并不准确可靠，部分感染病例无法确诊。可能造成病情的拖延^[12]。免疫学方法的检测如放射免疫分析法（RIA）灵敏度极高，但耗时长且需要同位素标记分子生物学检测的技术RT-PCR已广泛应用于诺如病毒检测并成为金标准，其中多重RT-PCR能同时诊断诺如病毒、轮状病毒以及星状病毒，尤其是低浓度的诺如病毒。其最大优点是可以进一步对病毒进行基因型研究不受分型干扰。但是诺如病毒的高变异性使开发对所有变异株的检测方法很困难。也正以为如此，诺如病毒的疫苗研制进程缓慢，至今为止，尚无有效稳定的可以用于大规模接种的疫苗，业务安全的抗毒血清用于紧急防护高危人群。本课题旨在筛选人诺如病毒特异性抗原表位，构建表达人诺如病毒特异性抗原表位的工程菌。通过优化工程菌的培养条件，筛选出高表达的条件。纯化获得可溶性高纯度蛋白，并进行纯度鉴定和抗原性分析，用于免疫制备抗体及检测试剂的研制。

拟研究或解决的问题（研究内容）

通过查阅文献和向指导老师请教，利用生物软件对病毒的外壳蛋白进行分析，利用基因工程技术大量表达特异性蛋白，分离纯化，并鉴定表达蛋白的抗原性

实验流程

1）筛选出诺如病毒的特异性抗原

2）选择元原核表达系统偏爱的密码子，设计基因序列