GPCR信号转导复合物的交联质谱技术研究文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

一、课题背景

G 蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors, GPCRs）是细胞信号传导中的重要蛋白质，因其具有特征性的7次跨膜拓扑结构，又被称为7次alpha;螺旋跨膜受体。作为激素，神经递质，离子，光子和其他刺激物的受体，GPCRs是细胞内部和外部环境之间交流的基本节点¹。GPCRs的经典作用是与配体结合之后与特定异源三聚体G蛋白偶联，从而导致下游效应蛋白的调节。脊椎动物中的GPCRs通常根据其序列和结构相似性分为A (Rhodopsin)，B1(Secretin)，B2 (Adhesion)，C (Glutamate)，F (Frizzled) 和 Taste 2 这六大家族^2,3。Class A受体是最大的GPCRs受体家族，这类受体的主要配体多为小分子等化合物。Class B1和B2受体一般都具有比较大的胞外结构域（Extracellular domain），其配体大多为多肽类化合物。Class C受体同样存在胞外结构域（Extracellular domain），主要负责结合对应的配体，而位于七次跨膜区域的结合口袋则负责结合变构调节分子。除了典型的七次跨膜螺旋结构，Class F受体都含有一个富含半胱氨酸的结构域（Cysteine-rich domain），并且F受体家族的序列同源性与其他家族相差较大。 Class B1 和Taste 2在受体激活状态，变构调节和G蛋白结合的状态下会产生相同的构像变化，这为 GPCRs 领域深入理解结构变化机制提供了研究契机。

GLP-1R是一种B类G蛋白偶联受体（GPCRs），与所有B类GPCRs一样，GLP-1R含有大的细胞外N-末端结构域（ECD）和七次跨膜螺旋束，多肽结合跨越两个结构域；多肽N末端与ECD相互作用，C末端定位在受体核心域，从而促进受体活化。在胰岛细胞中，GLP-1R 主要是促进胰岛素的释放，增加胰岛 beta; 细胞的再生，抑制 beta; 细胞的凋亡，降低胰高血糖素的释放。在胃肠道等组织中，GLP-1R 可以通过与其激动剂结合抑制胃肠道的蠕动和胃液分泌，延迟胃的排空，增加饱食感。在神经组织中，小分子 GLP-1R 激动剂能够穿透于大脑激活 GLP-1R 表达的神经元子集，保护神经细胞的凋亡和加强学习记忆能力。所以，GLP-1R 作为 GLP-1 发挥效能的靶点对于人们研究多种疾病有着潜在的指导意义⁴。例如，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是响应食物摄入和胃运动而分泌的关键肠促胰岛素激素之一，通过激活GLP-1R刺激胰岛素分泌，从而保持葡萄糖的稳态。市场上已经有几种针对GLP-1R的治疗糖尿病的肽类药物在销售，这些药物每年的总体销售额可达几十亿美元。在全世界，与治疗糖尿病及其并发症相关的成本一年超过2000亿美元。糖尿病在全世界以惊人的速度在增加。近些年来，许多制药公司都在积极地寻找可以替换这些肽类药物的口服小分子药物，然而，结合肽类分子的GPCRs存在多种连接点，开发针对它们的小分子药物充满着挑战⁵。

化学交联质谱技术(chemical cross-linking coupled with mass spectrometry)，是近年来发展起来的新方法．通过使用化学交联剂 (chemical cross-linker) 处理蛋白质样品，将空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键的形式连接起来⁶，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学手段分析交联产物，从而得到蛋白质结构和蛋白质相互作用等信息。在不同细胞环境中建立“蛋白质社会学”的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在几乎所有生物过程中起着关键的调节作用，包括发育，细胞稳态，生长和增殖。异常的蛋白质-蛋白质相互作用导致各种人类疾病，包括癌症。调节蛋白质-蛋白质相互作用代表了一种新兴的治疗范例，研究蛋白质相互作用为开发新的药物靶标提供了可能。因此，了解蛋白质相互作用网络不仅对于全面了解蛋白质功能和调节至关重要，而且还为更好的治疗方法提供了潜在的目标。已经开发了几种方法，包括酵母双杂交系统，蛋白质微阵列，荧光成像和亲和纯化-质谱，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。由于样品制备策略，质谱技术和生物信息学工具的新发展，亲和纯化与质谱（AP-MS）相结合的技术因其具有灵敏度高，准确性好，多功能性以及速度快等优点，现已成为研究系统级蛋白质-蛋白质相互作用的首选方法⁷。

1. 要解决的问题

本研究旨在通过化学交联质谱的手段对GLP-1R的复合物结构进行研究，从而为研究配体结合受体的分子机理及受体激活或抑制的内在机制提供理论依据，为进一步探寻 2 型糖尿病的治疗方案提供有利的帮助。

1. 可行性分析

1.通过化学交联质谱（XL-MS）鉴定邻近的氨基酸有助于蛋白质复合物的结构分析。已有研究者通过应用适合的XL-MS方案，在人类细胞亲和纯化的蛋白质复合物的模块化相互作用网络上获得了结构信息⁸。

2. 已有文献通过一定的方法使得GLP-1R在体外条件下仍保持其原有的结构和活性⁹。

3. 实验室具备优良的实验仪器，为实验的顺利进行提供了保障。

1. 研究方法和内容
2. 培养易于转染的HEK293T细胞系。
3. 构建重组质粒，在重组质粒多克隆位点插入带有生物素标签的目的蛋白序列。
4. 重组质粒瞬时转染进入HEK293T细胞，在合适的培养基中培养HEK293T细胞以期使其稳定地表达蛋白质。
5. 将细胞用一定浓度的甲醛处理，固定细胞内的相互作用网络。
6. 使用裂解缓冲液裂解细胞。以微量离心机的最大速度离心裂解物一定时间后以除去细胞碎片。
7. 加入去垢剂将疏水膜蛋白从细胞膜上溶解下来。
8. 基于生物素标签对蛋白质使用链霉亲和素磁珠进行亲和纯化。
9. 为了使样品损失最小化，将结合的蛋白质样品直接进行随后的LysC/胰蛋白酶消化和质谱分析。
10. 使用pLink进行蛋白质鉴定。
11. 工作计划

3月1日—3月10日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。