EphB2突变体融合蛋白的构建与原核表达文献综述

开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）

拟研究或解决的问题

Eph家族蛋白参与了机体炎症、肿瘤、损伤、血管生成、细胞生长、凋亡等多种病理及生理过程^[1]。Eph受体与其配体的结合，可刺激一系列细胞信号传导途径，参与调节细胞的运动、粘附、增殖、存活和组织模式的关键方面^[2]。迄今为止，已经有研究强调了Eph/Ephrin分子与肝纤维化相关的关键功能特性^[3]，而肝星状细胞的活化是纤维发生的肌成纤维细胞的主要来源，是肝纤维化的主要驱动力。EphB2是其中的一员，与其配体Eprin-B之间的信号传递介导了许多重要的生理过程，在胚胎形成、神经元的迁移定向、轴突路径导引和血管形成等方面有着重要的作用。

采用的研究手段

为了研究EphB2的生物学功能，拟采用分子生物学技术，构建EphB2激酶结构域突变体的真核表达载体，应用pTT5质粒在293F细胞中表达EphB2突变体融合蛋白，利用HIS标签纯化EphB2突变体融合蛋白, 并用蛋白免疫印迹对蛋白进行鉴定，为后续功能研究奠定基础。

文献综述

肝纤维化是急性或慢性肝损伤损伤后组织修复的代偿反应，表现为细胞外基质的过度积累以及由此导致的肝功能丧失。肝纤维化的特点是多余的纤维结缔组织形成和沉积，导致进行性的组织重塑^[4]。在肝纤维化发展为肝硬化的过程中，肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)由静止状态活化为成肌纤维细胞，大量分泌ECM，是肝纤维化发生乃至肝硬化进展的主要细胞学基础^[5]。

EphB受体在细胞形态、粘附、迁移和侵袭中起着关键作用，它们的异常行为与多种疾病的发生、相关肿瘤类型发展密切。它们在癌组织中相互矛盾的表达模式，以及它们的高表达

序列和结构的一致性，对那些寻求开发针对这个大受体家族的选择性治疗分子提出了有趣的挑战。研究发现EphB存在四种激酶，在已有的对于EphB激酶结晶能力与稳定性的实验验证中，考虑到这四种酶之间的高度序列一致性（从EphB2和EphB4之间的83%到EphB1和EphB2^[6]之间的89%），人们可能会认为所有四种酶都可以通过X射线晶体学进行结构测定，但这不是案例.EphB4似乎是四种同功酶中最易结晶的，尽管也是最难重组产生的，并且表现出最低的稳定性。然而，这与先前发表的大型结构生物学实验室的数据一致，表明稳定性不是蛋白质结晶能力的决定性因素。^[7]

与细胞外基质结合的许多配体部分Eph受体已经被鉴定，但是，与可利用的生长因子不同，这些配体是锚定在细胞表面（潘迪等人评论，1995）。当细胞与细胞接触时，表达配体能够影响细胞或细胞的行为。在已提出的Eph受体与其配体之间相互作用的指导性排斥模式，用以支持在雏鸡视觉通路形成期间视网膜神经节细胞精确投射到视结构中（Cheng et al.，1995；Drescher et al.，1995；Nakamoto et al.，1996；Monschau et al.，1997），以及将迁移的神经嵴细胞和运动轴突引导到发育中体节的头端（Wang和Anderson，1997）。在通过几个Eph受体基因（包括EphB2）的同源重组失活后，观察到表明轴突导向缺陷的神经异常（Henkemeyer等人，1996；Orioli等人，1996；Park等人，1997）。^[8]